星形胶质细胞集群作为跨日记忆痕迹稳定记忆的关键机制

《Nature》：The astrocytic ensemble acts as a multiday trace to stabilize memory

本研究揭示了星形胶质细胞通过情绪体验诱导的转录预激活和重复经验触发的功能性响应，形成跨日记忆痕迹的新机制。发现恐惧记忆提取（FR）特异性招募星形胶质细胞Fos+集群，该过程依赖于去甲肾上腺素（NA）信号与局部印迹神经元的协同作用，并通过IGFBP2分泌调控记忆稳定性，为理解情绪记忆巩固提供了细胞层面的新视角。

　　

星形胶质细胞集群作为跨日记忆痕迹稳定记忆

记忆提取会暂时 destabilize 记忆痕迹，需要重新稳定（re-stabilization）才能形成长期记忆。尽管这一过程对人类认知和神经精神疾病具有重要意义，但针对生存关键经历（通常具有情绪显著性和重复性特征）的记忆稳定机制尚不完全清楚。记忆痕迹与特化的神经元集群（neuronal engrams）相关，但神经元Fos作为可塑性标记物 alone 不足以解释记忆稳定，暗示需要 additional cellular substrates。

脑内广泛分布的星形胶质细胞与神经元和其他胶质细胞存在结构和功能相互作用。星形胶质细胞具有发育多样性和适应性改变分子程序的能力，这种可塑性类似于经验依赖性神经元反应（如Fos上调）和后续形成的跨区域神经元印迹网络。然而，星形胶质细胞通过大量细胞表面受体对神经活性生物分子产生多样化反应，使得确定特定星形胶质细胞亚群如何整合多重输入以生成特定状态变得困难。

全脑范围星形胶质细胞Fos集群标记

为无偏倚地整体识别行为相关星形胶质细胞集群（BAEs），研究团队开发了全脑星形胶质细胞Fos标记工具，能够永久遗传访问因特定经验而表达Fos的BAEs。通过系统验证新型遗传和成像策略，证明了星形胶质细胞选择性、Fos敏感性和时间调控性。使用中枢神经系统（CNS）广谱转导的腺相关病毒（AAV）载体（AAV-PHP.eB）与星形胶质细胞特异性GfaABC₁D启动子，实现了广泛、星形胶质细胞选择性（97.3–99.5%）的表达。通过表达Cre依赖性mNeonGreen（mNG）作为瞬时星形胶质细胞Fos诱导的标记物，在Fos-iCre^ERT2（TRAP2）小鼠中采用交叉方法，仅在快速作用的4-羟基他莫昔芬（4-OHT）给药期间Fos启动子活跃时驱动星形胶质细胞mNG表达，实现了跨CNS的行为时期特异性星形胶质细胞Fos标记。

记忆提取诱导星形胶质细胞集群

在学习范式中广泛探索BAEs，研究采用情境恐惧条件化和提取任务。TRAP2::AAV-PHP.eB-GfaABC₁D-DIO-mNG小鼠经过3天 habituated 以最小化情境新颖性，隔离恐惧学习和提取的关联成分。在第4天，一组接受3次足底电击并立即给予4-OHT（FC），另一组在FC后24小时提取后立即给予4-OHT（FR）。对照组包括未受电击小鼠（NoFC）或在家庭笼中保持24小时且未进行提取即给予4-OHT的恐惧条件化小鼠（NoFR）。电击组在条件化 chamber 中表现出 robust freezing，表明学习和提取。一周后，全脑连续双光子断层扫描（STPT）能够检测单个mNG⁺星形胶质细胞（BAEs）。

虽然Fos⁺神经元数量在FC和FR期间均增加，形成与恐惧记忆痕迹因果关联的网络（通常称为印迹神经元），但FC期间的星形胶质细胞Fos⁺密度（FC-BAE）很少与NoFC对照组（NoFC-BAE）区分开。然而，发现提取期间（FR-BAE）的BAEs数量在多个脑区增加。这并非简单地反映FC后延迟的Fos上调，因为FR中的Fos诱导显著高于NoFR。跨印迹区域的归一化比较显示，与FC-BAEs相比，FR-BAEs数量显著更多，尤其是在杏仁核中，该区域长期以来被证实与跨物种恐惧记忆相关。一致地，在杏仁核外侧和基底外侧区（LA/B），星形胶质细胞c-Fos蛋白在FC或NoFR versus NoFC后未改变，但FR在1.5小时诱导了显著增加，并在6小时部分 decay。

信号汇聚诱导星形胶质细胞Fos

为识别星形胶质细胞Fos诱导的机制，研究结合了药理学筛选、环路遗传学、在体成像和转录组学。激活神经元c-Fos的生长因子未触发原代星形胶质细胞中的c-Fos信号，表明神经元和星形胶质细胞中c-Fos的诱导机制不同。鉴于积累的证据表明星形胶质细胞G蛋白偶联受体（GPCR）激活上调c-Fos表达，研究用多种与星形胶质细胞表达GPCR结合的神经递质刺激原代星形胶质细胞，观察到去甲肾上腺素（NA）增加了c-Fos信号。星形胶质细胞c-Fos信号被propranolol（拮抗Gα_s偶联的β-肾上腺素受体） abolished，但不被prazosin（拮抗Gα_q偶联的α₁-肾上腺素受体）或atipamezole（拮抗Gα_i偶联的α₂-肾上腺素受体）阻断。星形胶质细胞c-Fos诱导对Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM resistant，而膜通透性Ca²⁺离子载体ionomycin未增加星形胶质细胞c-Fos信号。然而，腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536抑制cAMP产生，减弱了由腺苷酸环化酶–cAMP激活剂forskolin、β-受体激动剂isoproterenol或NA诱导的星形胶质细胞c-Fos信号。这些数据表明NA主要通过Gα_s偶联的β-受体和 subsequent increases in cAMP诱导原代星形胶质细胞中的c-Fos信号。

在体星形胶质细胞响应局部环路和长程神经调节剂。数据表明局部活动也有助于在体Fos诱导。考虑到体外和体内星形胶质细胞之间的转录差异，特别是代谢型谷氨酸受体3（mGluR3，由Grm3编码）在培养星形胶质细胞中的表达减少，而其在成年在体星形胶质细胞中丰富表达，研究通过AAV异源表达mGluR3于原代星形胶质细胞以模拟在体环境。在表达mGluR3的星形胶质细胞中，谷氨酸 alone 无效，但与NA结合强烈增强了c-Fos强度。在mGluR3阴性星形胶质细胞中未观察到这种协同作用。因为Gα_i偶联的GPCR如mGluR3可以在Gα_q–磷脂酶Cβ共激活时增强Gβγ–Ca²⁺信号，NA可能招募α₁-受体（Gα_q）和mGluR3（Gα_i）与β-受体–cAMP通路合作。支持这一点，ionomycin诱导的Ca²⁺信号在与NA、isoproterenol或forskolin结合时增强了c-Fos。因此，星形胶质细胞c-Fos主要由β-受体–cAMP驱动，并受到汇聚的谷氨酸和NA信号进一步 potentiated。

为在体验证这一汇聚，研究在LA/B和蓝斑核（LC）中表达神经元特异性hM3Dq，用CNO刺激它们。当仅激活LA/B或LC神经元时，Fos-mNG⁺星形胶质细胞数量保持较低，但当两者均被刺激时显著增加。这提供了在体证据，表明 coincident 局部和去甲肾上腺素能输入诱导星形胶质细胞Fos。

提取触发的NA–星形胶质细胞信号

数据支持一个汇聚模型，其中NA和印迹活动诱导星形胶质细胞Fos。然而，由于这两种活动在FC和FR期间均发生，在提取期间比条件化期间更强的星形胶质细胞Fos诱导提出了星形胶质细胞如何在 recall 期间比条件化期间产生更强响应的问题。为解决这一问题，研究检查了在恐惧学习和提取过程中NA释放和星形胶质细胞cAMP–Ca²⁺信号动态，使用在体光纤光度法。部署AAV2/9-hSyn1-GRAB_NE2h监测自由行为小鼠LA/B中的 bulk NA信号。在FC前24小时的 habituated 期间，当小鼠被放置到情境A（CtxA；足底电击 chamber）时观察到NA信号，可能反映了轻度应激源和/或运动。在情境NA信号之上，单次足底电击在LA/B中 evoked 增强且相对快速（半衰期=4.3分钟）的NA响应。此外，在情境恐惧提取（FR）期间观察到进一步增强（峰值ΔF/F=0.211±0.022）和 prolonged（半衰期=13.5分钟）的NA信号。延长的NA信号在情境B（CtxB）中 absent，表明情境恐惧的 recall 驱动 sustained NA信号。

研究接下来使用双色光纤光度法测量星形胶质细胞cAMP和Ca²⁺信号。与NA信号一致，cAMPinG1信号在 habituated 和足底电击期间增加，在约2分钟内完全 decay。然而，在FR日，星形胶质细胞显示出渐进式cAMP增加，在CtxB中 absent。在体β-受体拮抗（propranolol） abolished 了FR期间的星形胶质细胞cAMP信号，这抑制了FR-BAE诱导和 freezing。足底电击 elicited 星形胶质细胞Ca²⁺信号，并且Ca²⁺事件频率在FR期间增加。这些数据 collectively 表明恐惧经历诱导杏仁核内NA信号的增强，在FR期间通过β-受体强烈触发星形胶质细胞cAMP信号。

跨日星形胶质细胞状态变化

FR期间增加的星形胶质细胞cAMP–Ca²⁺信号提出了星形胶质细胞如何在 recall 期间比条件化期间产生更强响应的问题，尽管NA释放和印迹神经活动在两种恐惧经历中均发生。为解决这一问题，研究检查了在NoFC、FC、NoFR和FR条件下星形胶质细胞中经验依赖性分子变化。在行为测试后90分钟解剖杏仁核组织，并使用ATP1B2抗体ACSA2通过荧光激活细胞分选（FACS）分离星形胶质细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。经过质量控制，获得了1,903个星形胶质细胞的 profiles，并识别出4个转录不同的星形胶质细胞簇（AST1–4）。未观察到跨条件下亚簇组成的显著变化，表明FC和FR不改变簇 identity。Fos阳性星形胶质细胞占总星形胶质细胞的2.9–4.2%，与早期数据一致。值得注意的是，FR星形胶质细胞显示出最高的Fos水平，与BAE标记一致。

后续分析揭示了Adra1a（α₁-受体）和Adrb1（β₁-肾上腺素受体）作为杏仁核星形胶质细胞中两个主要表达的肾上腺素受体基因。值得注意的是，两种受体在FC组（FC后1.5小时）中上调，并在NoFR组（FC后24小时无 recall）中进一步升高，表明星形胶质细胞随时间持续 priming。这些数据表明了一个模型，其中初始恐惧经历诱导星形胶质细胞分子状态改变，具有延迟性，增加肾上腺素受体表达以增强NA信号，并使未来重复恐惧 evoked Fos诱导在FR期间成为可能。星形胶质细胞肾上腺素受体表达的增强可能 underlie FR期间NA–β-受体驱动的cAMP信号和强恐惧记忆 recall 后一天Fos诱导。

为测试这一模型，研究探索了肾上腺素受体表达的时间变化、它们与FR-BAE诱导的联系，以及它们在Fos诱导中的因果作用。检查了FC后Adra1a和Adrb1表达的时间过程，使用在条件化后1.5小时、1天、2天、3天和14天收集的杏仁核切片进行单细胞RNAscope。Adrb1表达在条件化后1.5小时至3天显著增加（约两倍 versus NoFC），但在14天时返回基线。相比之下，Adra1a表达在条件化后1天增加，在2至3天时部分 decay，并在14天时再次达到峰值。计算每个细胞的共表达指数（相对Adrb1表达×相对Adra1a表达），发现在FC后1天达到峰值，随后逐渐下降。为测试这一分子 profile 是否预测 recall 期间星形胶质细胞Fos诱导的程度，在FC后多个时间点（1天、2天、3天和14天）进行FR-BAE标记。与肾上腺素受体共表达时间过程一致，FR-BAE密度在1天时达到峰值，随后下降，表明FR-BAE诱导的明确时间窗口。

星形胶质细胞集群稳定记忆

转录组学使得能够探究与功能输出相关的FR-BAEs分子变化。挖掘Adrb1阳性和Adrb1阴性星形胶质细胞之间差异表达基因，识别出Igfbp2在Adrb1阳性星形胶质细胞中高度上调。单细胞RNAscope揭示了Adrb1和Igfbp2的高度相关表达，表明星形胶质细胞Adrb1上调可能促进Igfbp2诱导。Igfbp2编码分泌蛋白IGFBP2，最近报道在恐惧 recall 后杏仁核的“peri-neuronal engram”Fos⁺星形胶质细胞中富集。

鉴于IGFBP2及其结合伙伴胰岛素样生长因子（IGFs）对突触可塑性至关重要，并且慢性删除IGFBP2破坏突触传递、环路成熟和记忆，研究假设FR-BAE^LA/B中的IGFBP2表达有助于 recall 后环路去稳定和重新稳定。用时空特异性在体药理学扰动IGFBP2测试了这一假设。在CtxA中FR后立即通过植入的引导套管 bilateral 输注IGFBP2中和抗体。小鼠接受重复每日输注和FR会话，持续五天。IGFBP2-Ab处理减少了 freezing 与对照组相比，表明记忆稳定受损；输注IgG的对照组无变化。结合转录组学、RNAscope和药理学扰动数据表明星形胶质细胞亚群在恐惧经历后增加肾上腺素受体表达，增强NA响应性，并驱动 recall 诱导的Fos和Igfbp2诱导以稳定恐惧记忆。

为直接检查FR-BAE信号在记忆稳定中的因果作用，进行了功能丧失实验选择性靶向LA/B中的FR-BAEs。使用iβARK，一种遗传编码的122-氨基酸肽，结合Gα_q–GTP以抑制GPCR信号。在杏仁核星形胶质细胞的离体Ca²⁺成像中，iβARK减少了α₁-受体 evoked Ca²⁺响应相对于其突变对照，尽管一些残留振荡活动 persisted。为提高 efficacy，通过将原始肽与膜锚定Lck结构域融合开发了iβARK2，实现更有效的基于 proximity 的抑制。iβARK2在星形胶质细胞 compartments 包括精细过程中显示 robust 膜定位。表达iβARK2的星形胶质细胞显示出显著衰减的Ca²⁺响应相对于iβARK和对照iβARK2mut。接下来生成iβARK2和iβARK2mut的Cre依赖性AAV版本，用于在Fos-iCre^ERT2 TRAP小鼠中选择性靶向FR-BAEs。显著地，用iβARK2沉默FR-BAEs损害了重复 recall 后的记忆稳定，与星形胶质细胞衍生IGFBP2中和观察到的行为效应一致。此外，与iβARK2mut对照相比，表达iβARK2的小鼠中星形胶质细胞IGFBP2水平显著降低，表明FR-BAEs中GPCR信号的抑制破坏了 recall 依赖性转录诱导的IGFBP2并损害记忆稳定。

星形胶质细胞-神经元印迹调控记忆

为进一步探索BAE信号对神经元印迹和记忆形成的因果影响，进行了功能获得实验靶向LA/B中星形胶质细胞β₁-受体。用AAV2/5-GfaABC₁D-Adrb1转导星形胶质细胞用于Adrb1过表达（Adrb1-OE）显示与对照相比显著增加的Igfbp2表达。Adrb1过表达也增加了FR-BAEs（Fos-mNG⁺星形胶质细胞）的密度约三倍相对于对照，表明星形胶质细胞β₁-受体过表达放大 recall 诱导的星形胶质细胞集群。

接下来功能评估了增强星形胶质细胞集群的行为效应。在开放场地中的走动或 habituated 期间在中心区域花费的时间在对照和Adrb1-OE小鼠之间未检测到差异。然后测试了Adrb1过表达是否影响记忆稳定。采用三击条件化，两组在初始 recall 和重新巩固后的第二次 recall 期间显示等效 freezing，可能由于天花板效应。为创建参数空间以检测记忆增强，用弱（单击）条件化范式训练小鼠。Adrb1-OE小鼠在FC后一天的FR期间未显示改变的 freezing；然而，Adrb1-OE小鼠在第二次 recall 期间表现出显著增加的 freezing，表明初始 recall 后重新巩固后记忆稳定增强。在另一采用三击条件化的队列中，初始 recall 在组间 freezing 无显著差异。然而，在改变情境（CtxB）中观察到Adrb1过表达小鼠的 freezing 显著增强相对于对照。这些数据表明初始恐惧记忆的过度稳定导致泛化或记忆 precision 丧失。

最后，探索了恐惧泛化是否伴随印迹神经元的活动。双侧注射AAV2/8-hSyn1-DIO-mCherry伴或不伴AAV2/5-GfaABC₁D-Adrb1，并在FR期间标记印迹神经元。在CtxB freezing 测试后1.5小时处死小鼠，并通过c-Fos免疫反应性评估FR印迹神经元的重新激活。mCherry⁺神经元（FR印迹神经元）的总数在组间无显著差异，但显示恐惧泛化的Adrb1-OE小鼠中FR印迹神经元中的c-Fos水平显著高于对照小鼠。这些发现表明更大的星形胶质细胞集群有助于增强印迹神经元的后续重新激活，与记忆可提取性不是在记忆形成期间决定但可能在记忆检索后 regulated 的观点一致，并证明星形胶质细胞参与这一关键过程。

这些数据表明星形胶质细胞可以连接至少一天时间尺度上的离散恐惧经历。与一个多世纪前假设和最近在脑计算中 implicated 的一致，星形胶质细胞可能以比神经元更慢的时间尺度整合信息。虽然神经元和星形胶质细胞传统上在毫秒 versus 秒到分钟尺度上进行比较，但发现揭示了在天数尺度上功能显著的不匹配。与在FC和FR期间均表达立即早期基因的神经元不同，星形胶质细胞响应恐惧条件化（FC）具有快速Ca²⁺和cAMP增加，但经历较慢的转录状态变化。单细胞转录组学和RNAscope揭示了在FC后多天，无 recall，星形胶质细胞上调Adra1a和Adrb1，标记一个学习依赖性状态，促进在重复经历（FR）期间增强响应。这反过来驱动Fos和Igfbp2表达，支持记忆稳定。本研究中识别的星形胶质细胞集群可能部分满足印迹细胞的标准，这些细胞在经历后经历持久的生化变化。然而，发现表明星形胶质细胞集群可能不作为编码经验特异性信息的直接记忆痕迹像神经元一样，因为其扰动未改变初始恐惧 recall。相反，它可能作为记忆稳定的资格痕迹 over days，在支持与重复经历相关记忆稳定的环路内创建许可性微环境。从计算和生物能量学角度，星形胶质细胞可能 underlie 回顾性链接，这受益于学习会话之间跨天的间隔间隔，通过提供补充快速神经元活动的慢调制痕迹，从而卸载跨天维持神经元放电模式的能量昂贵任务，并实现更稳定的环路转换。

来自动物和人类影像学研究的积累证据强调了杏仁核和NA在调节长期记忆中的作用。早期靶向蛋白质合成、β-受体、PKA或cAMP–CREB在杏仁核中的药理学研究破坏了记忆重新稳定，发现表明这可能部分由星形胶质细胞介导。表明星形胶质细胞经历学习依赖性增加肾上腺素受体表达，并且操纵这些受体改变记忆稳定性、精确性和神经元印迹表征。值得注意的是，NA输入和重新激活的神经元印迹活动均需要招募星形胶质细胞集群以稳定不稳定的记忆。这些发现暗示星形胶质细胞集群可能不仅仅是NA信号的被动 bulk substrates，而是通过星形胶质细胞定义的微电路施加行为相关、环路特异性调控。通过β1R过表达破坏精确的NA–星形胶质细胞信号导致恐惧泛化，表明生理性星形胶质细胞作用在选择性记忆稳定性中约束适应不良更新。在这方面，靶向这些星形胶质细胞-神经元相互作用机制可能有益于治疗认知和神经精神功能障碍，包括创伤后应激障碍，其中NA系统过度活跃是一个突出特征。

破译多样化星形胶质细胞响应如何连接到多重电路输出长期以来一直是一个挑战。自从首次报道以来，相当大的努力致力于探测或扰动星形胶质细胞Ca²⁺信号，但因果关系通常从单独 subjects 推断，留下输入-输出链接不清楚。星形胶质细胞扰动的 bulk 方式也与星形胶质细胞 identity、状态和响应的异质性不一致。方法通过利用情境特异性星形胶质细胞状态变化 bridge 这一差距：全脑BAE标记方法使得能够广泛探索因果用于神经处理和行为的集群。这一框架促进了跨多样化行为和疾病条件的星形胶质细胞集群研究。扩展这些努力将加速在需要理解多细胞相互作用作为脑生物学核心属性的计算和病理学中的发现。