人类肠道温和噬菌体的分离、工程改造与生态学：诱导机制、宿主互作及群落调控研究

《Nature》：Isolation, engineering and ecology of temperate phages from the human gut

本研究针对人类肠道中大量预测但功能未知的温和噬菌体，通过培养252株肠道细菌分离株，系统评估了10种诱导条件下134个可诱导前噬菌体的特征。研究发现仅18%的计算预测前噬菌体可在纯培养中被诱导，而合成微生物群落与人类结肠细胞（Caco2）共培养时诱导率提升至35%。首次证实人类宿主细胞裂解产物可作为前噬菌体诱导触发器，揭示了肠道细胞损伤与噬菌体激活的潜在关联。研究还发现多溶原性普遍存在且导致协同诱导，而差异整合位点影响诱导效率。该工作通过培养学方法为肠道噬菌体生物学提供了关键实验证据，对合成生物学和微生物组应用具有重要价值。

　　

在人类肠道这个复杂的微生物生态系统中，噬菌体（bacteriophages）作为细菌病毒扮演着关键角色。它们通过捕食作用、水平基因转移和溶原性转换等方式塑造着微生物群落的结构与功能。近年来，宏基因组学的发展揭示了肠道中存在着极其丰富的噬菌体多样性，其中溶原性（lysogeny）尤为普遍——高达90%的肠道细菌被预测携带前噬菌体（prophages）。然而，这些整合在细菌基因组中的噬菌体在何种条件下会重新进入裂解周期，它们与宿主细菌如何相互作用，以及它们在肠道生态系统中的具体功能，至今仍是未解之谜。

传统的计算生物学方法虽然能够预测大量前噬菌体序列，但缺乏实验验证使得我们对这些预测元件的生物学意义理解有限。特别是，关于前噬菌体从溶原状态切换到裂解状态的诱导机制、诱导频率以及环境因素（如宿主生理状态、群落互作和人类宿主因子）对这一过程的影响，知之甚少。这一知识缺口严重制约了我们全面理解噬菌体在肠道健康与疾病中的作用，也阻碍了将噬菌体应用于微生物组工程和治疗的进展。

为了填补这一空白，研究人员开展了一项系统性的实验研究，旨在通过培养学方法直接探究人类肠道温和噬菌体的生物学特性。该研究以252株来自人类肠道的细菌分离株为材料，涵盖了放线菌门（Actinomycetota）、厚壁菌门（Bacillota）、变形菌门（Pseudomonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和梭杆菌门（Fusobacteriota）等主要门类，对这些细菌中预测的前噬菌体进行了全面的诱导实验和功能验证。

研究团队采用了多层次的实验策略：首先在纯培养条件下测试了8种不同的诱导剂，包括丝裂霉素C（mitomycin C）、过氧化氢（hydrogen peroxide）、甜菊糖苷（Stevia）以及营养饥饿条件等；随后构建了一个包含78个菌株的合成微生物群落（synthetic microbiome），研究细菌共培养以及与人结肠上皮细胞（Caco2）共培养对前噬菌体诱导的影响；最后还探究了人类细胞本身及其裂解产物是否能够直接触发前噬菌体的诱导。通过这些实验，研究人员不仅验证了可诱导噬菌体的存在，还深入分析了它们的基因组特征、分类学地位、在真实肠道病毒组中的流行度，以及诱导能力与宿主遗传背景、前噬菌体整合位点等因素的关联。

关键技术方法包括：细菌分离与培养（252株人肠道细菌分离株）、前噬菌体计算预测（Virsorter、Vibrant、VirFinder）、多条件诱导实验（10种诱导条件）、病毒颗粒分离与测序（PEG沉淀、DNase处理）、合成群落构建与共培养（78株菌）、宏基因组与病毒组数据分析（read mapping、k-mer分析）、比较基因组学与进化分析（dN/dS计算）、基因编辑验证（CRISPR-Cas系统敲除前噬菌体基因）等。

Induction of human gut isolates

研究人员从252株肠道细菌分离株中成功诱导出125个可诱导的肠道前噬菌体，代表63个噬菌体物种，来自73株细菌（占29%）。值得注意的是，只有18%的高质量预测前噬菌体在纯培养条件下可被诱导。不同诱导剂的效果各异：两种浓度的丝裂霉素C诱导了最多数量的前噬菌体（n=70），而过氧化氢则诱导了最多的拟杆菌门噬菌体（n=35）。与标准生长条件下的自发诱导（n=36）相比，这些经典诱导剂的诱导效果仅略有提升。

Human cellular products induce prophages

合成微生物群落实验显示，在与Caco2细胞共培养时，前噬菌体诱导物种比例从17%显著提升至35%。在排除了群落效应后，纯培养实验进一步证实人类细胞裂解产物能够特异性诱导前噬菌体，其中Caco2细胞裂解物条件诱导了25个前噬菌体，而完整细胞层和DMEM培养基分别诱导了14个。这表明人类宿主相关细胞产物确实可以作为前噬菌体诱导的触发器，为胃肠道细胞裂解与温和噬菌体种群动态之间的联系提供了实验证据。

Only a fraction of gut prophages were induced

尽管94%的细菌分离株被预测含有高质量前噬菌体区域，但所有测试条件下仅有32%的分离株被诱导，对应18%的高质量预测前噬菌体（或24%的物种）。拟杆菌门分离株中预测与诱导的一致性最高（44%分离株，27%预测前噬菌体可诱导），而变形菌门虽然每个分离株的平均预测前噬菌体数量最多（4.5个），但仅12%被诱导。结合群落实验，总共36%的噬菌体物种被检测到诱导，与人类肠道宏基因组的最新报道（8-36%）相符。

Taxonomy of induced gut temperate phage

通过基因共享网络分析，133个噬菌体被归类为有尾噬菌体目（Caudoviricetes），1个属于丝状噬菌体目（Faservicetes）。其中26%的噬菌体可在科级或更低水平被归类为ICTV接受的分类单元。特别值得注意的是，19个噬菌体与最近描述的Hankyphage聚类，形成了一个新的推定属，命名为Hankyvirus。该属噬菌体在NCBI RefSeq数据库中被发现在9个属、5个科的52个宿主物种中存在，表明其具有广泛的宿主范围。

DGRs are common within gut prophages

研究发现13个（19%）可诱导前噬菌体物种含有多样性生成逆转录元件（Diversity-generating retroelements, DGRs），其中大多数存在于拟杆菌门噬菌体中（43%的物种编码DGRs）。值得注意的是，研究人员发现了四个前噬菌体物种含有第二个可变区（variable region, VR），位于逆转录酶盒的远端，表明DGRs在噬菌体-宿主军备竞赛中的进一步参与。

Differential gene enrichment patterns

与预测但未诱导的前噬菌体相比，可诱导前噬菌体在结构基因（头部与包装、连接子、裂解和尾部）上显著富集。而非诱导的前噬菌体则富含附属基因和功能未知基因。对高度相似的可诱导-非诱导前噬菌体对的比较发现，基因频率没有显著变化，表明基因丢失可能不是前噬菌体失活的初始原因。

Excision gene mutations trap prophages

非同义替换率与同义替换率之比（dN/dS）分析显示，前噬菌体的总体突变率高于宿主基因组。重要的是，在非诱导前噬菌体中，整合和切离相关基因的dN/dS替代率显著增加，表明这些基因的功能丧失性突变为前噬菌体的失活提供了一条途径。研究人员通过构建可诱导前噬菌体Pomma的DNA转座蛋白基因缺失突变体（Pomma△tran）验证了这一假设：在野生型菌株中，甜菊糖苷和过氧化氢处理分别导致Pomma浓度增加3.5和2.6个对数，而在突变体中没有检测到诱导，证明切离基因的失活确实能将前噬菌体"困"在宿主基因组中。

Polylysogeny and host genetics influence induction

多溶原性（polylysogeny）在拟杆菌门分离株中最为普遍（68%的溶原菌含有一个以上可诱导前噬菌体）。研究发现多溶原性与成功的诱导条件数量呈正相关，表明多溶原性可能促进同步的前噬菌体诱导并降低溶原菌的稳定性。此外，在五个高度相似（99% ANI）且携带相同两个前噬菌体（Wilby和Pomma）的Bacteroides caccae分离株中，研究人员观察到了差异诱导现象，这与前噬菌体在宿主基因组中的不同整合位点相关。Wilby通过位点特异性整合插入相同的tRNA基因位点，而可转座的前噬菌体Pomma在五个分离株中位于四个不同的基因组位置，表明整合位点是观察到的差异诱导的可能驱动因素。

讨论与结论

本研究通过系统的培养学方法，揭示了人类肠道温和噬菌体的复杂生物学特性。研究证实，尽管肠道细菌中预测的前噬菌体数量庞大，但仅有少部分在实验条件下可被诱导进入裂解周期。这一发现挑战了我们对肠道噬菌体活跃度的传统认知，表明大多数前噬菌体可能处于长期沉默或"驯化"（domestication）状态。

人类宿主因素，特别是细胞裂解产物，被证明是前噬菌体诱导的重要触发器，这为理解炎症性肠病等肠道疾病中观察到的噬菌体扩张现象提供了机制性解释。多溶原性的普遍存在以及其对诱导的促进作用，揭示了噬菌体群体间复杂的相互作用。而前噬菌体整合位点的差异对诱导效率的影响，则强调了宿主遗传背景在调控噬菌体行为中的重要性。

在基因组特征方面，非诱导前噬菌体中结构基因的减少以及整合/切离基因的突变积累，描绘了前噬菌体失活和驯化的可能路径。DGRs的广泛存在和进化信号表明，这些元件在噬菌体适应不断变化的宿主环境中持续发挥着活跃作用。

这项研究的意义在于它将计算预测与实验验证紧密结合，提供了大量经过验证的噬菌体-宿主对，为未来研究提供了宝贵的资源。所建立的实验方法和分析框架为在复杂微生物群落中研究病毒动力学树立了新标准。这些发现不仅深化了我们对肠道噬菌体生物学的理解，也为开发基于噬菌体的微生物组调控策略、噬菌体疗法以及合成生物学应用奠定了坚实基础。

最终，该研究强调了培养学方法在微生物组研究中的不可替代价值，表明尽管宏基因组学能揭示巨大的多样性，但只有通过分离培养和功能验证，才能真正理解微生物世界的功能逻辑和生态规则。这项工作为未来探索人类肠道中病毒-细菌-宿主三者互作的复杂网络开辟了新的道路。