劫持细菌ABC转运蛋白实现遗传密码扩展的高效策略

《Nature》：Hijacking a bacterial ABC transporter for genetic code expansion

本研究发现非经典氨基酸（ncAA）摄取效率低是制约遗传密码扩展（GCE）的关键瓶颈，并通过工程化改造细菌ATP结合盒（ABC）转运蛋白（如Opp）成功克服了这一限制。研究者利用异肽键连接的三肽（Z-XisoK）作为"特洛伊木马"，使其被Opp转运蛋白主动摄入大肠杆菌（Escherichia coli）后，在胞内酶解释放出高浓度的ncAA，从而实现了多种难以高效摄取的功能性ncAA（如生物正交基团、交联剂、翻译后修饰（PTM）模拟物等）的高效编码。该工作还建立了高通量定向进化平台，可定制化改造转运系统，为蛋白质功能研究和生物技术应用提供了强大工具。

　　

劫持细菌ABC转运蛋白实现遗传密码扩展

摘要

位点特异性编码非经典氨基酸（ncAA）为扩展蛋白质的功能库提供了强大工具。然而，当前ncAA掺入策略的低效率限制了其在基础研究和生物技术应用中的广泛使用。本研究揭示了细胞对ncAA的摄取不足是高效遗传密码扩展的主要障碍，并通过劫持细菌ATP结合盒（ABC）转运蛋白克服了这一瓶颈。该策略能主动导入易于合成的异肽键连接的三肽，这些三肽在细胞内被加工成ncAA。利用这种方法，我们实现了多种先前难以获得的ncAA的高效编码，为蛋白质装备了生物正交基团、交联剂部分、翻译后修饰以及用于化学酶促连接的功能团。我们进一步设计了一个高通量定向进化平台，以工程化定制转运系统，用于导入历史上难以高效摄取的ncAA。表达这些进化后转运蛋白的定制化大肠杆菌菌株能够以野生型效率实现单一位点和多位点的ncAA掺入。此外，我们调整了三肽支架以共同转运两种不同的ncAA，实现了它们的有效双重掺入。总的来说，我们的研究表明，工程化摄取系统是程序化导入化学多样性构建单元的强大策略。

正文

引言

通过遗传密码扩展（GCE）进行共翻译掺入ncAA，能够精确重编程蛋白质组的化学多样性。通过利用正交氨酰-tRNA合成酶（aaRSs），一系列功能，包括翻译后修饰（PTMs）、生物正交手柄、交联部分、光谱探针和光笼氨基酸，已通过琥珀抑制在所有生命领域的感兴趣蛋白质（POIs）中实现位点特异性引入。尽管取得了实质性进展，但GCE的广泛实施仍然受到低蛋白质产量的限制。效率低下源于正交aaRSs对底物激活不足，以及氨酰化tRNA在引入的无义密码子处与释放因子的不利竞争。此外，许多ncAA需要高级化学合成专业知识，并且在典型实验中以高浓度使用，使其成本高昂，而低掺入产量加剧了这一因素。

多项努力通过优化的aaRS/tRNA表达系统结合新的选择和进化策略来解决这些限制，这些策略提高了抑制效率。额外的进展包括正交核糖体、释放因子敲除和允许有义密码子重分配的重新编码的基因组。

一个探索较少但关键的因素在于ncAA的细胞内生物利用度。在大多数GCE应用中，ncAA被外源性添加到细胞中，并通过被动扩散或通过天然氨基酸转运蛋白摄取。这通常导致低细胞内浓度，这对于催化效率低的aaRS/ncAA对尤其不利，因为其氨酰化在低于最佳条件下进行。此外，对被动扩散和内源性导入器的依赖限制了新型构建单元的可利用设计空间。对于少数ncAA，通过工程化生物合成途径直接在细胞内生产它们已经克服了一些限制，但这种方法需要大量的菌株开发，并且目前仅适用于狭窄范围的功能。

工程化膜转运系统是增强ncAA摄取的一种有前景但尚未充分探索的策略，并具有广泛应用的潜力。先前的工作研究了一种周质亮氨酸结合蛋白对已知ncAA的底物范围，以及"特洛伊木马"策略，其中ncAA与载体基团缀合，以促进转运蛋白的识别和摄取。

主要发现

G-A_isoK被转运到大肠杆菌中

先前的工作将转肽酶与GCE结合以生成确定的蛋白质-蛋白质缀合物。通过位点特异性编码一个叠氮保护的二甘氨酸受体基序（AzGG_isoK），然后进行蛋白质上的Staudinger还原，带有GG_isoK的蛋白质可以与带有C末端识别序列的供体蛋白质进行转肽化。我们应用此策略，使用分选酶或天冬酰胺内肽酶作为转肽酶，生成泛素（Ub）和泛素样修饰物（Ubl）-POI缀合物。

为了使生成的蛋白质缀合物中的连接序列多样化，我们探索了位点特异性掺入类似于通用G-X_isoK支架的ncAA。用带有丙氨酸的G-X_isoK三肽（G-A_isoK）补充大肠杆菌K12，能够使用野生型甲烷八叠球菌吡咯赖氨酸-tRNA合成酶/tRNA对（wt-MbPylRS/PylT）高效地琥珀抑制超折叠GFP（sfGFP-N150TAG），其产量与野生型sfGFP生产相当，并且与金标准ncAA BocK相似。质谱分析揭示了A_isoK的位点特异性掺入，表明N末端甘氨酸在游离ncAA上、共翻译或翻译后被酶切切割。相比之下，直接用A_isoK补充K12导致可忽略的sfGFP产量。活细胞sfGFP荧光测量证实了这一点，显示A_isoK信号极弱，而G-A_isoK诱导的荧光比BocK更早、更强。

为了研究潜在机制，我们进行了基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的摄取测定。补充G-A_isoK后，我们在细胞内未检测到任何G-A_isoK，但A_isoK的积累浓度比直接用A_isoK补充K12高5到10倍。

这些发现使我们假设一种特定的转运机制主动将G-A_isoK导入细胞。在细胞质内，G-A_isoK被酶加工成A_isoK，后者以高浓度积累并作为MbPylRS的底物，导致高效的A_isoK编码。

ABC转运蛋白实现G-X_isoK摄取

在革兰氏阴性菌如大肠杆菌中，小肽通过外膜孔蛋白扩散进入周质。在内膜内，两个主要的肽转运蛋白类别促进肽摄取到细胞质中：质子依赖性寡肽转运蛋白（POTs）和ABC转运蛋白。

为了识别G-A_isoK的潜在摄取系统，我们筛选了缺失单个转运蛋白或转运蛋白结构域的大肠杆菌单基因敲除库，通过在存在wt-MbPylRS/PylT对和G-A_isoK的情况下，对sfGFP-N150TAG进行琥珀抑制。我们假设所需转运蛋白的缺失会减少或消除sfGFP表达。虽然缺失POT家族成员和二肽特异性ABC转运蛋白没有效果，但构成opp操纵子的单个基因的敲除完全消除了G-A_isoK存在下的sfGFP表达。

Opp ABC转运蛋白由周质结合蛋白（OppA）、两个跨膜结构域（TMDs）（OppB和OppC）和两个驱动ATP水解的细胞质核苷酸结合结构域（NBDs）（OppD和OppF）组成。肽结合的OppA停靠到TMDs，触发ATP结合和底物易位到细胞质中。OppA、两个TMDs或NBDs中任何一个的单独缺失导致G-A_isoK的琥珀抑制和sfGFP荧光完全丧失，但BocK不受影响，表明Opp依赖的G-A_isoK摄取。摄取测定证实，与野生型K12相比，ΔoppA-K12中的细胞内BocK水平未变，而在用G-A_isoK处理的K12中积累到毫摩尔浓度的A_isoK，在oppA缺失时检测不到。

为了识别负责将G-A_isoK加工成A_isoK的酶，我们使用缺失特定氨肽酶的单基因敲除库，用G-A_isoK进行了琥珀抑制实验。然而，十个测试的敲除中没有一个对琥珀抑制产量产生影响。因此，我们使用基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑平台生成多重肽酶敲除。值得注意的是，只有同时缺失pepN和pepA的细胞（ΔpepN/pepA）显示用G-A_isoK时sfGFP表达显著降低，而BocK的琥珀抑制产量不受影响。用pepA或pepN中的任何一种进行互补恢复了G-A_isoK存在下的sfGFP表达，表明任一种肽酶都足以进行G-A_isoK加工。

总之，这些发现支持了一个模型，即G-A_isoK通过Opp转运蛋白主动导入大肠杆菌细胞质，在那里被内源性肽酶加工，释放A_isoK用于高效的琥珀抑制。

通用的G-X_isoK工具箱

接下来，我们测试了通用G-X_isoK支架中的氨基酸是否表现相似。确实，带有丝氨酸而不是丙氨酸的S_isoK，在三肽（G-S_isoK）依赖的方式下被类似地掺入。已知OppA混杂地结合2到5个氨基酸长的肽，偏爱带正电荷的侧链。为了探索OppA如何区分G-X_isoK和X_isoK，我们解析了OppA与G-S_isoK结合的晶体结构（PDB ID: 9RD1）。该结构与先前的配体结合OppA构象良好重叠，并采用闭合状态，G-S_isoK封闭在结合口袋中。G-S_isoK通过其主链和末端与OppA进行广泛的相互作用。其质子化的α-胺与D445相互作用，而C末端羧酸盐通过涉及R439、H397和N392侧链的氢键稳定。为了验证这些相互作用，我们在ΔoppA中表达了OppA变体。表达野生型OppA完全恢复了G-S_isoK存在下的sfGFP表达，而破坏与G-S_isoK N末端α-胺相互作用的D445A变体未能恢复表达。靶向G-S_isoK C末端氢键网络的突变（例如R439A）影响较小，表明OppA结合位点具有一定的结构灵活性。这些结果突出了甘氨酸的α-胺与D445之间的相互作用对于有效OppA结合和转运的关键作用。

OppA–G-S_isoK晶体结构显示与丝氨酸侧链没有特异性相互作用，后者被容纳在一个宽敞的口袋中。这表明OppA结合和摄取主要依赖于三肽主链和末端的识别，而不是侧链身份。因此，这种机制可能代表一个更通用的概念，适用于在G-X_isoK支架内呈现的各种ncAA。因此，我们扩展了我们的前肽策略，以有效掺入带有GCE常用功能的X_isoK衍生物，包括用于位点特异性蛋白质缀合和交联的部分。用G-X_isoK衍生物（其中X代表各种侧链）补充大肠杆菌K12，能够使用wt-MbPylRS/PylT或通过细胞内筛选鉴定的合适合成酶变体，高效抑制sfGFP-N150TAG和Ub-K63TAG。质谱分析确认了相应X_isoK二肽的位点特异性掺入，而补充游离X_isoK衍生物导致最小的蛋白质表达。

X_isoK衍生物的有效遗传编码值得注意，因为用20种经典氨基酸中的任何一种进行赖氨酸氨酰化（在ε-氨基上）是最近发现的可逆PTM。先前直接通过GCE编码S_isoK、T_isoK、P_isoK或C_isoK的尝试被证明效率极低。我们的策略提供了一种高效的替代方案，为研究这些PTM的功能研究奠定了基础。C_isoK修饰的蛋白质也非常适合天然化学连接方法。将获得的C_isoK掺入效率与使用特异性进化的PylRS变体的先前产量进行比较，突显了主动导入G-C_isoK的优势，表明细胞内ncAA浓度对于高效ncAA掺入可能比广泛的PylRS工程化更关键。

X_isoK衍生物的位点特异性掺入能够安装带有α-胺部分的氨基酸，有效地创建第二个人工N末端用于内部标记。例如，G-P_isoK摄取允许安装带有游离α-胺的内部脯氨酸，并使用化学酶促方法用苯酚衍生物进行标记。酪氨酸酶将

p

-甲酚氧化成相应的_o-醌，后者与P_isoK中的脯氨酸α-胺氧化偶联，从而能够特异性和定量地标记带有P_isoK的POIs。

当我们筛选用于庞大或芳香族X侧链（如H_isoK）的PylRS变体时，使用G-H_isoK没有出现命中。为了探究这是由于Opp转运不良还是缺乏适当的H_isoK特异性PylRS变体，我们使用定制设计的MbPylRS文库进行了定向进化。一种新的MbPylRS变体支持用G-H_isoK掺入H_isoK，但不能用H_isoK，表明OppA也递送带有庞大或芳香族X侧链的G-X_isoK衍生物。含组氨酸的ncAA的高效编码可以扩展人工金属酶中金属配位位点的范围。

我们进一步拓宽了G-X_isoK工具箱，引入了用于生物正交标记和交联的非经典X侧链。我们前肽策略的一个相当大的优势是，G-X_isoK衍生物可以通过固相肽合成从商业可得的构建单元轻松大规模合成，克服了先前方法的合成限制。一个含丙炔基的衍生物（G-Prg_isoK）能够将Prg_isoK高效安装到eGFP特异性纳米抗体（eGFPNb）中，并随后通过Cu(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）进行荧光团标记。使用G-Prg_isoK掺入Prg_isoK与最近报道的使用专用Prg_isoK-PylRS变体的效率相比具有优势。

为了映射和捕获蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），我们使用我们的前肽策略高效掺入交联剂。将光亮氨酸（pL），一种商业可得的ncAA，作为X掺入G-X_isoK支架，使得能够将二氮丙啶编码到POIs中。UV诱导的交联通过捕获PPIs证实了功能性，例如成功交联了谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和sfGFP二聚体。

对于基于邻近性的交联，我们设计了G-ClA_isoK以赋予POIs氯丙氨酸（ClA）特性。用G-ClA_isoK补充K12导致高效的ClA_isoK掺入，使得能够与相互作用蛋白质中附近的亲核试剂（如半胱氨酸）进行S_N2介导的交联。通过在蛋白质-蛋白质界面成对掺入ClA_isoK和半胱氨酸残基，我们共价稳定了各种低亲和力PPIs（解离常数（K_d）在微摩尔到低毫摩尔范围），包括sfGFP同源二聚体、亲和体-蛋白质Z和Rab1b–DrrA复合物。相应Cα原子之间8–12 ?的距离可以被有效交联。

通过OppA进化实现可扩展的X_isoK编码

所有测试的G-X_isoK三肽在化学定义的自动诱导（AI）培养基中实现了高效的蛋白质生产，但在营养丰富的条件下，如2-YT培养基中则不能。我们假设胰蛋白胨和蛋白胨丰富培养基中的短肽可能与G-X_isoK三肽竞争OppA结合。支持这一点的是，补充G-S_isoK后，2-YT培养基中的细胞内S_isoK水平比AI培养基低六倍，表明在营养丰富条件下OppA介导的摄取受损。这对G-X_isoK工具箱的可扩展、成本效益高的使用构成了挑战，因为AI培养基昂贵、制备繁琐并导致较低的生物量，从而降低了ncAA修饰蛋白质的表达产量。

为了克服这一点，我们工程化了一种OppA变体，其对G-S_isoK的选择性高于线性三肽。我们开发了一个基于荧光激活细胞分选（FACS）的平台，通过在不断增加胰蛋白胨浓度的连续富集过程中，筛选在ΔoppA细胞中包含wt-MbPylRS/PylT对和sfGFP-N150TAG的错误倾向OppA文库。该系统将G-S_isoK三肽的摄取与sfGFP荧光耦合。鉴定出四个汇聚的OppA变体，其具有分布在整个OppA折叠上的四个或五个突变。突变热点被靶向进行饱和诱变，获得的文库经过多轮基于FACS的富集步骤，在肽丰富培养基中产生最终的OppA变体（OppA-iso）。OppA-iso包含七个突变，只有R439Q发生在结合位点附近。通过λ-red介导的同源重组将OppA-iso基因组整合到K12基因组中，创建了IsoK12菌株。IsoK12和亲本K12在AI和2-YT培养基中显示出相似的倍增时间。在2-YT培养基中，补充G-S_isoK时，IsoK12表现出比K12高7到10倍的细胞内S_isoK浓度，而BocK水平保持不变，证实了OppA-iso增强了G-S_isoK转运。值得注意的是，IsoK12将2-YT培养基中的琥珀抑制效率恢复到K12在AI培养基中观察到的水平。

使用微量热泳动分析显示，野生型OppA和OppA-iso对S_isoK表现出相似的低结合亲和力（约300 μM），而OppA-iso对G-S_isoK表现出略微改善的亲和力（37 μM），与野生型OppA（50 μM）相比。值得注意的是，线性GSK三肽（模拟线性胰蛋白胨肽）与OppA-iso的结合比野生型OppA（71 μM）低四倍（275 μM），验证了其改变的选择性。

结构分析表明，OppA-iso中大多数突变的残基不直接接触G-S_isoK。一个值得注意的例外是R439，它位于配体C末端的氢键距离内，在OppA-iso中被谷氨酰胺取代。由于R439A突变体仍然支持高效的G-S_isoK摄取，结合可能通过H397和N392的补偿性相互作用维持，它们处于与G-S_isoK的赖氨酸羧酸盐相互作用的有利位置。相比之下，线性三肽如GSK依赖于R439进行结合，因此其突变降低了亲和力，与结构和结合数据一致。

值得注意的是，OppA-iso的摄取益处扩展到其他G-X_isoK衍生物。在2-YT培养基中生长的IsoK12对所有测试的X残基（A, S, T, C, V, L, P, H, Prg, pL和ClA）实现了高效的琥珀抑制，截断最少，产量与在AI培养基中获得的相当。事实上，IsoK12中的三肽摄取如此高效，以至于低至50–100 μM的G-S_isoK浓度与K12中使用1 mM G-S_isoK的掺入水平相匹配，将所需的ncAA浓度降低了约10倍。

G-X_isoK/IsoK12系统能够在各种目标蛋白质（PCNA, β-内酰胺酶, SUMO2, 钙调蛋白, eGFPNb, 白细胞介素-2, 人生长激素, RanGAP和Hsp82）的不同位置高产率地掺入X_isoK，大小范围从7到85 kDa，包括治疗相关的例子。抑制效率超过了BocK，并与野生型水平相当。制备规模大规模生产带有Prg_isoK的eGFPNb导致纯化蛋白质产量（44 mg l^?1）与野生型表达（41 mg l^?1）相似，超过了先前优化的炔烃-ncAA/PylRS组合的产量。

通过高效的三肽摄取增加细胞内ncAA浓度也促进了多位点琥珀抑制。我们将最多三个TAG密码子引入组蛋白H3（K27, K79和K122），并用G-S_isoK表达相应的变体。IsoK12在单次、双重和三次抑制中优于K12，在前两种情况下实现野生型样表达，即使对于三次抑制也产生显著的H3产量。相比之下，BocK仅产生痕量的双重和三次抑制变体。

使用Z-A_isoK实现通用ncAA摄取

鉴于OppA在底物识别中的适应性，我们设想了一种广泛适用的策略，使用单个易于合成的Z-X_isoK三肽共同递送两个ncAA。为了利用这种机制将位点特异性双ncAA掺入单个蛋白质，我们设计了肽16，带有作为Z的AcK（一种PTM）和作为X_isoK的pL_isoK（一种光交联剂）。这样的设置将是研究PTM特异性蛋白质相互作用物或化学稳定瞬时POI-reader复合物的理想工具。

值得注意的是，用于AcK和pL_isoK的PylRS/PylT对是相互正交的。在OppA介导的摄取和16的切割之后，AcK和pL_isoK都在细胞内积累，允许在同一目标蛋白质（sfGFP-N40AcK-N150pL_isoK）内使用相应的PylRS/PylT对双重抑制TAA和TAG密码子。值得注意的是，当细胞补充三肽16时，蛋白质产量显著高于添加游离AcK和G-pL_isoK，强调了转运蛋白介导的递送的增强效率。全长sfGFP的LC-MS确认了AcK和pL_isoK的双重掺入。相互正交性和两个ncAA的准确解码还通过使用含有烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶位点的Ub–SUMO2融合构建体（Ub-K48TAG-TEV-SUMO-K11TAA）显示。TEV切割后的LC-MS分析揭示了在Ub的TAG48处特异性掺入pL_isoK，并在SUMO2的TAA11处编码AcK。

讨论

低蛋白质产量和许多ncAA有限的化学可及性仍然是常规应用GCE生成具有治疗或生物技术潜力蛋白质的主要障碍。在这里，我们通过将模块化前肽策略与Opp转运蛋白的程序化"劫持"相结合，克服了这些限制，实现了广泛范围ncAA的主动和定制化导入，包括那些历史上难以高效摄取和编码的ncAA。异肽键连接的Z-X_isoK三肽充当"特洛伊木马"，可以通过固相肽合成从商业可得的构建单元轻松合成，并作为周质结合蛋白OppA的 privileged 配体，使其能够通过ATP驱动转运到细胞质中。一旦进入细胞，Z-X_isoK三肽被酶加工，导致细胞内积累异肽键连接的X_isoK ncAA和Z残基。使用基于FACS的定向进化方法，我们重新编程了OppA，以选择性区分复杂培养基中存在的线性肽。由此产生的工程化大肠杆菌菌株IsoK12，能够在营养丰富的条件下以最小的三肽浓度实现成本效益高、高产率的修饰蛋白质生产。该平台允许稳健地掺入11种先前难以获得的X_isoK ncAA，扩展了通过GCE可用的化学空间。这些功能包括带有生物正交手柄、新型PTM、化学和光交联剂以及用于化学酶促连接的功能团的ncAA，我们都在原理验证应用中进行了演示。X_isoK ncAA的带正电荷侧链使其成为蛋白质标记等应用的理想部分，其中表面暴露位置的位点定向掺入至关重要。这种策略避免了通常用于标记目的的庞大、疏水性ncAA常见的聚集和错误折叠。

值得注意的是，Z-X_isoK三肽的摄取和加工也可以用于定制化递送和细胞内积累具有挑战性的Z残基，这些残基通常缺乏细胞渗透性。通过合成14种不同的Z-A_isoK三肽面板，我们证明A_isoK掺入sfGFP可作为三肽有效摄取和加工的简单读数，从而无需进行基于质谱的密集型摄取测定。我们的平台为开发具有特定结合位点的OppA变体奠定了基础，这些变体能够携带否则细胞不可渗透的Z残基的三肽，例如庞大和带负电荷的基团。因此，我们的创新使得这些具有挑战性的ncAA的细胞内递送成为可能。从Z-X_isoK进行Z残基的位点特异性掺入显著优于直接Z补充。由于针对特定Z残基的OppA进化与Z特异性正交aaRS的可用性脱钩，我们的系统提供了一个实用和模块化的策略，用于将ncAA摄取与其共翻译掺入解耦，补充了最近