基于荧光咔唑-肼类探针的快速开发：对对香豆酸的检测

《Journal of Molecular Structure》：Rapid discovery of fluorogenic carbazol-hydrazine-based probes: p-coumaric acid sensing

基于羰基香豆素检测需求，开发新型荧光探针3h通过金属游离C-H胺化反应一步合成，DFT计算验证其与p-CA的氢键相互作用机制，实现0-160μM范围内线性荧光响应，检测限1.31μM，在商业饮料中成功定量检测。

　　这项研究聚焦于开发一种新型的荧光探针，用于检测和量化重要的生物活性化合物——对香豆酸（p-Coumaric acid，简称p-CA）。p-CA是一种广泛存在于植物中的酚酸，因其在人体健康方面的积极作用，如抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗糖尿病、抗突变以及抗阿尔茨海默病等特性，受到了科研界的广泛关注。此外，p-CA还表现出神经保护、肝保护、肾保护和紫外线防护等有益作用，因此在食品、化妆品、药品和工业化学品等多个领域都有应用。然而，由于p-CA在复杂基质中的检测和定量存在诸多挑战，如高仪器成本、样品预处理、高真空操作、耗时过程以及对专业人员的依赖，使得其广泛应用受到限制。

为了克服这些局限性，研究团队提出了一种基于荧光光谱技术的新方法，利用有机小分子荧光探针实现对p-CA的高效、简便和高灵敏度检测。相比传统的分析方法，荧光光谱技术具有操作简单、实时性强、非破坏性等优势，因此成为一种有潜力的检测手段。然而，目前关于p-CA的荧光探针研究仍较为有限，尤其是在探针的合成方法上，往往需要多步反应，不仅增加了生产成本，也降低了原子经济性。因此，寻找一种快速、高效的合成路径对于推动该领域的研究具有重要意义。

本研究中，团队通过一种全新的金属自由、室温下的C–H胺化反应，成功合成了具有荧光特性的咔唑-肼类化合物，作为p-CA的检测探针。这一反应过程使用了三氟乙酸作为唯一的催化剂，实现了对咔唑和偶氮二羧酸酯的直接胺化，无需额外的金属试剂或复杂的反应条件。这种单步合成方法大大简化了探针的制备过程，提高了反应效率和可操作性。在合成过程中，团队对反应参数进行了系统性筛选，包括酸的种类、溶剂的选择、反应温度以及底物比例，最终确定了最佳的反应条件。

合成的咔唑-肼类化合物中，N-萘基取代的探针3h表现出优异的荧光性能。该探针在与p-CA发生相互作用时，能够通过双重氢键作用产生浓度依赖性的荧光猝灭现象。这种响应机制使得探针能够在较宽的浓度范围内（0–160 μM）提供线性荧光信号，从而实现对p-CA的精确检测。进一步的实验结果表明，探针3h的检测限（LOD）为1.31 μM，定量限（LOQ）为4.37 μM，显示出良好的灵敏度和准确性。此外，该探针还具有较大的斯托克斯位移（140 nm），这意味着其激发光和发射光之间的波长差较大，有助于减少背景干扰，提高检测的信噪比。

为了深入理解探针3h与p-CA之间的相互作用机制，研究团队进行了密度泛函理论（DFT）计算。通过计算，他们首次确认了氢键在探针与p-CA识别过程中的关键作用。这一发现不仅为探针的设计提供了理论依据，也为后续开发更高效的荧光探针奠定了基础。此外，DFT计算还揭示了探针在与p-CA结合时的电子结构变化，进一步支持了其荧光响应的可逆性和特异性。

探针3h的应用前景十分广阔，特别是在实际样品的检测中表现出色。研究团队成功地将该探针应用于商业饮料样品的p-CA检测，验证了其在复杂基质中的适用性。这一成果表明，探针3h不仅在实验室条件下具有良好的性能，而且在实际应用中也具备可行性。这种能力对于食品工业、环境监测以及药物研发等领域都具有重要意义，因为它可以快速、准确地检测食品中可能存在的p-CA含量，从而确保食品安全和质量。

值得一提的是，探针3h是首个专门设计用于p-CA检测的有机小分子荧光探针。这一突破性成果不仅拓展了荧光探针的应用范围，还为其他生物活性物质的检测提供了新的思路和方法。咔唑-肼类化合物的合成方法具有广泛的适用性，能够为不同类型的生物分子提供多样化的检测探针。此外，这种合成方法的简便性和高效性也为大规模生产和应用提供了可能。

在材料和仪器方面，研究团队使用了多种市售试剂，如咔唑衍生物1a、1b、1g、1l和1m，以及偶氮二羧酸酯（DEAD）、p-CA、二氯甲烷（DCM）、甲醇、乙醇、石油醚和乙酸乙酯等。这些试剂均来自上海Titan Scientific，具有较高的纯度。实验过程中使用的仪器包括紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪等，用于表征探针的光物理性质和检测其与p-CA的相互作用。

合成过程中的关键步骤是咔唑与偶氮二羧酸酯在特定条件下的C–H胺化反应。通过系统优化反应条件，研究团队实现了对咔唑C3位点的选择性胺化，从而生成了具有特定结构的咔唑-肼衍生物。这一反应路径的创新在于其无需金属催化剂，能够在室温下完成，极大地简化了反应流程。此外，这种反应方式具有较高的选择性和效率，使得探针的合成更加便捷和经济。

探针3h的荧光响应特性使其成为p-CA检测的理想工具。其在与p-CA结合时表现出显著的荧光猝灭，这种变化可以通过荧光光谱进行直观观察和定量分析。同时，探针3h在不同浓度下的线性响应范围也表明其具有良好的检测可靠性。此外，斯托克斯位移的较大值（140 nm）意味着其在检测过程中能够有效避免激发光与发射光之间的重叠，从而提高检测的准确性和信噪比。

在实验结果的验证过程中，研究团队对探针3h在不同基质中的性能进行了测试，特别是在商业饮料样品中的应用。测试结果表明，探针3h能够准确检测饮料中的p-CA含量，这一成果为该探针的实际应用提供了有力支持。此外，研究团队还对探针的稳定性和重现性进行了评估，确保其在实际检测中的可靠性和一致性。

这项研究的创新点在于开发了一种全新的、高效的合成方法，不仅简化了探针的制备过程，还提高了其检测性能。通过选择性地引入萘基团，探针3h在荧光响应和检测灵敏度方面表现出色。这一方法的成功应用不仅为p-CA的检测提供了新的解决方案，也为其他生物活性物质的检测探针开发提供了参考。

总的来说，这项研究在p-CA检测领域取得了重要进展，提出了一种高效、简便且具有高灵敏度的荧光探针合成方法。探针3h的开发不仅解决了传统检测方法中存在的诸多问题，还为相关领域的研究提供了新的工具和思路。未来，研究团队计划进一步优化探针的性能，拓展其应用范围，并探索其在其他生物分子检测中的潜力。这一研究的成果有望在食品安全、环境监测和生物医药等领域发挥重要作用，推动相关技术的快速发展和实际应用。