基于多重平行反应监测实验设计的电子活化解离技术优化及其在糖肽注释与糖链定位中的应用

《Journal of Proteomics》：Enhancing glycopeptide annotation and glycan localization using electron activated dissociation through a multiplexed parallel reaction monitoring design of experiments

本研究针对糖蛋白分析中糖肽鉴定和糖链定位的挑战，开发了一种基于热电子捕获解离的电子活化解离（EAD）优化策略。研究人员通过实验设计（DoE）与多重平行反应监测（PRM）相结合，系统优化了液相色谱-质谱（LC-MS）参数和EAD特异性参数。结果表明，优化后的EAD方法相较于传统的碰撞诱导解离（CID），能显著提高糖链定位的可信度，为糖蛋白的精准表征提供了新方案，在生物制药开发和疾病生物标志物研究领域具有重要意义。

　　

在生命科学和医学研究领域，蛋白质的糖基化是一种至关重要且常见的翻译后修饰。糖蛋白不仅在生物体内扮演着多种关键角色，更作为治疗性蛋白质和疾病生物标志物受到广泛关注。例如，在自身免疫性疾病和癌症中，蛋白质的糖基化模式常常发生改变。因此，精确解析糖蛋白的结构，明确糖链的组成、结构以及它们在蛋白质上的具体连接位点（即糖基化位点），对于理解疾病机制、开发高质量生物药物具有不可替代的价值。然而，对糖蛋白进行精细表征一直是一项艰巨的挑战，特别是在糖肽水平上进行准确鉴定和糖链定位。

目前，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是分析糖肽的主流技术。其中，碰撞诱导解离（CID）是最常用的碎片化方式。但CID倾向于断裂糖链内部的糖苷键，产生丰富的糖链碎片信息，却难以有效断裂肽段骨架，导致用于确定肽段序列和糖链连接位点的关键信息（即“信息性糖肽碎片”）较少，从而影响了糖链定位的准确性。为了解决这一难题，科学家们将目光投向了电子解离技术，如电子捕获解离（ECD）和电子转移解离（ETD）。这类技术能够优先断裂肽段的酰胺键，产生c和z型离子，同时最大限度地保持糖链结构的完整，从而为糖肽的序列鉴定和糖链精确定位提供更可靠的证据。

近年来，SCIEX公司在其ZenoTOF 7600高分辨率四极杆-飞行时间质谱仪上推出的电子活化解离（EAD）技术，将电子动能范围扩展至0-15 eV，能够实现包括ECD、热ECD（hot ECD）和电子撞击激发有机离子（EIEIO）在内的多种解离模式。EAD技术解离速度快，甚至能够有效碎裂低电荷态（如1+和2+）的前体离子，大大拓宽了其在组学分析中的应用前景。已有研究开始利用EAD（特别是热ECD模式）分析O-和N-连接糖肽，并在区分唾液酸连接异构体、分析复杂及高度唾液酸化糖肽结构方面展现出巨大潜力。然而，如何系统化地选择和优化EAD的参数设置，以充分发挥其效能并获得与CID互补的信息，仍是当前糖蛋白组学领域亟待探索和规范化的课题。

针对上述问题，发表在《Journal of Proteomics》上的一项研究为我们提供了一个优秀的范例。来自巴塞罗那大学的研究团队以具有重要治疗意义且糖基化高度复杂的重组人促红细胞生成素（rhEPO）为模型糖蛋白，开发并优化了一套基于EAD的毛细管LC-MS/MS方法，旨在实现糖肽的可靠鉴定和位点特异性糖链定位。

为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术方法：首先，他们采用全因子实验设计（DoE）来高效优化LC-MS条件（如离子喷雾电压、离子源温度、活性梯度时间）和EAD关键参数（电子束电流、反应时间、电子动能）。其次，他们创新性地将多重平行反应监测（PRM）模式与DoE相结合，实现在单次进样中评估多组EAD参数组合，极大提高了优化效率。最后，他们利用数据依赖性采集（DDA）模式，在优化条件下对rhEPO酶解产物进行非靶向分析，并对比评估了CID和EAD两种碎裂技术在糖肽鉴定数量、糖链定位置信度等方面的表现。数据分析方面，他们比较了Byonic、Fragpipe和Mascot等不同软件以及多种峰提取算法对EAD数据的处理效果。

3.1. LC-MS条件的优化

研究人员首先通过DoE方法系统考察了离子喷雾电压、离子源温度和活性梯度时间对两个模型糖肽糖型（O₁₂₆-H1N1S2和N₈₃-H7N6F1S4）峰面积的影响。结果表明，离子喷雾电压是影响信号强度的最显著因素，最佳值约为4500 V。离子源温度则需在保证电离效率和避免源内碎裂（ISF）之间取得平衡，200 °C被证明是最佳选择。活性梯度时间设置为20分钟，能在保证良好糖型分离的前提下获得较高的峰强度。在此优化条件下，成功实现了O₁₂₆和N₈₃糖肽各糖型的高效分离和检测。

3.2. EAD碎裂条件的优化

研究团队创造性地利用PRM-DoE策略对EAD参数进行优化。他们针对模型糖肽糖型，监测其EAD碎裂产生的“信息性糖肽碎片”（即带有完整糖链的肽段碎片，如c7, c8, c9离子用于N₈₃糖肽）的总峰面积作为响应指标。结果显示，反应时间是影响碎片信号的最关键参数。最终确定的最佳EAD参数为：反应时间20 ms，电子动能7 eV，电子束电流7000 nA。在此条件下，EAD-MS/MS谱图主要产生c和z+1型肽段骨架离子，提供了高序列覆盖率和明确的糖基化位点信息，同时也能观察到少量糖链碎裂产生的氧鎓离子（如H1N1S1），表明EAD在保持糖链相对完整的同时，也能提供部分糖链组成信息。

3.3. EAD与CID碎裂在糖肽分析中的评估与比较

对比研究发现，CID和EAD提供了互补的结构信息。CID产生丰富的糖链糖苷键断裂和跨环断裂碎片，有助于解析糖链结构，但肽段骨架断裂较少，不利于糖链定位。而EAD则能产生丰富的肽段骨架碎片，为糖链定位提供高置信度的证据。特别值得注意的是，EAD在区分糖链异构体方面展现出独特优势。例如，对于部分分离的N₈₃-H8N7F1S4糖型色谱峰，EAD-MS/MS谱图显示两个峰的糖链碎裂模式存在差异，提示可能存在糖链结构异构体（如额外LacNAc单元的位置不同），而CID谱图则未能揭示这种差异。在DDA模式下对rhEPO酶解产物进行非靶向分析，并使用Byonic软件进行鉴定，结果显示：对于N₈₃位点（只有一个可能的N-糖基化位点），CID和EAD均能获得较高的定位置信度（Delta Mod分数）；而对于O₁₂₆位点（其肽段上存在多个可能的O-糖基化位点，如Ser120, Ser126, Thr132等），EAD能准确地将糖链定位到正确的Ser126位点，并给出远高于错误位点（如Ser120）的Delta Mod分数，显著优于CID。在鉴定糖型数量上，CID通常能鉴定出更多的糖型，但EAD在糖链定位的准确性方面更具优势。

3.4. 优化EAD-DDA方法的数据处理

研究还评估了不同峰提取软件（MSConvert, Mascot Distiller, Sciex MS Data Converter）和搜索引擎（Byonic, Mascot）对EAD数据处理效果的影响。结果发现，数据处理流程对鉴定结果有显著影响。Sciex MS Data Converter结合Byonic搜索能获得最好的鉴定效果。值得注意的是，即使使用非糖蛋白组学专用软件Mascot，在采用合适的峰提取流程后，也能有效地处理EAD产生的O-糖肽数据，这为更多实验室利用EAD技术进行糖肽分析提供了可能性。最后，将PRM-DoE优化后的EAD参数与文献报道的默认参数进行对比，应用优化参数的分析方法鉴定到了更多的O-糖肽糖型和肽段-谱图匹配数（PSMs），证明了系统优化的重要性。

综上所述，这项研究成功地建立了一套高效、系统的EAD参数优化策略，并将其应用于rhEPO糖肽的深度表征。该研究清晰地展示了EAD技术在提高糖链定位置信度、区分糖链异构体方面的巨大潜力，并与传统的CID技术形成了有力互补。更重要的是，该研究提出的基于DoE和PRM的优化方法具有普适性，可为使用类似仪器的糖蛋白组学研究提供重要参考。研究还指出，数据处理流程（尤其是峰提取）的选择对EAD糖肽数据的分析结果有显著影响，这是未来相关研究中需要特别注意的环节。这项工作不仅显著提升了糖蛋白表征的能力，也为推动电子解离技术在糖蛋白组学乃至更广泛的翻译后修饰研究领域的应用奠定了坚实的方法学基础。随着EAD技术的不断成熟和优化策略的推广，我们有理由期待它在揭示糖蛋白功能、加速生物药物研发和发现疾病新型生物标志物等方面发挥越来越重要的作用。