时序调控免疫-成骨生物陶瓷增强骨质疏松性骨缺损再生

《Materials Today Bio》：Sequentially Regulated Immuno-Osteogenic Bioceramics Enhance the Regeneration of Osteoporotic Bone Defects

本研究针对骨质疏松性骨缺损修复过程中炎症期延长、骨吸收过度等难题，构建了基于3D打印β-TCP支架的IL-4/AL时序控释系统。该功能化支架(TCP-PDA/AL-IL-4)通过早期快速释放IL-4促进巨噬细胞M2极化以改善免疫微环境，后期持续释放AL促进成骨分化并抑制破骨形成，最终在骨质疏松大鼠模型中显著增强新骨形成。该策略为骨质疏松性骨缺损的再生修复提供了新材料设计思路。

　　

骨骼具备强大的自我修复能力，然而，在骨质疏松（Osteoporosis）这种全身性骨骼疾病的影响下，骨修复过程会变得异常艰难。骨质疏松的特征是骨量减少、骨微结构破坏，导致骨骼脆性增加，易发生骨折。当骨质疏松患者出现骨缺损时，修复过程面临双重挑战：一方面，失衡的骨微环境导致炎症期延长，过度的炎症反应不利于组织再生；另一方面，破骨细胞（Osteoclast）活性异常增高，使得骨吸收远超过骨形成，严重阻碍了新骨的生成。传统的骨修复材料往往侧重于提供机械支撑或单纯的成骨诱导，难以应对这种复杂的病理微环境。因此，开发能够智能调控骨免疫微环境并协同促进骨再生的新型生物材料，成为骨组织工程领域的一个重要研究方向。

近日，发表在《Materials Today Bio》上的一项研究，为这一难题提供了创新的解决方案。研究人员设计并构建了一种具有时序调控免疫-成骨功能的生物陶瓷支架，该支架能够模拟天然骨修复的时序过程，先调控免疫反应，再促进骨重建，从而显著增强骨质疏松性骨缺损的再生效果。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：基于3D打印技术制备β-磷酸三钙（β-TCP）多孔支架作为基础材料；通过迈克尔加成反应和物理吸附法在支架上实现阿仑膦酸钠（AL）和白细胞介素-4（IL-4）的序贯负载与控释；利用骨质疏松大鼠股骨缺损模型进行体内骨再生效能评估；采用Micro-CT、组织学染色、免疫荧光、酶联免疫吸附测定（ELISA）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）等技术对材料的理化性质、细胞行为、动物实验效果进行系统表征与分析。

3.1. 支架的表征

研究人员首先成功制备了β-TCP支架，并利用聚多巴胺（PDA）在其表面进行修饰，进而通过化学偶联负载AL，通过物理吸附负载IL-4，构建了TCP-PDA/AL-IL-4功能化支架。表征结果显示，PDA修饰后在支架表面形成了纳米颗粒薄膜，并成功引入了AL。接触角测试表明PDA修饰显著提高了支架的亲水性。蛋白质吸附实验显示改性后的支架具有更强的蛋白吸附能力。最重要的是，体外释放曲线证实了IL-4在2天内快速释放（约80%），而AL在14天内持续缓慢释放（最终累积释放率约80%），实现了预期的时序释放目标。

3.2. 体外免疫调节

细胞实验表明，所有支架均具有良好的细胞相容性。与RAW264.7巨噬细胞共培养后，TCP-PDA/AL-IL-4支架能显著促进抗炎因子IL-10和成骨相关因子BMP-2的分泌，同时抑制促炎因子TNF-α的分泌。免疫荧光和RT-PCR结果进一步证实，该支架能有效诱导巨噬细胞向M2表型极化，表现为M2标志物（CD206, Arg-1, IL-10）基因表达上调，而M1标志物（CCR7, IL-6, TNF-α）基因表达下调。这表明IL-4的早期释放有效缓解了炎症反应，并创造了有利于成骨的免疫微环境。

3.3. 巨噬细胞条件培养基增强mBMSCs的成骨分化

为了验证M2型巨噬细胞旁分泌作用对成骨的影响，研究人员收集了经不同支架处理的巨噬细胞条件培养基，用于培养小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。划痕实验表明，TCP-PDA/AL-IL-4组条件培养基能最有效地促进mBMSCs的迁移。碱性磷酸酶（ALP）活性和染色显示，该组条件培养基诱导的mBMSCs表现出最高的ALP活性。RT-PCR结果显示，成骨相关基因（Runx-2, ALP, COL-I, OPN, OCN, VEGF）的表达在TCP-PDA/AL-IL-4组中均显著上调。这表明由M2型巨噬细胞分泌的细胞因子能有效促进mBMSCs的成骨分化。

3.4. 体外成骨和破骨分化的调节

直接将mBMSCs与支架共培养发现，TCP-PDA/AL-IL-4支架能促进细胞铺展，并显著提高ALP活性以及成骨相关基因（COL-I, OPN, OCN）的表达。在破骨分化实验中，与支架共培养并经RANKL诱导的RAW264.7细胞，在TCP-PDA/AL-IL-4支架上表现出最低的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性以及最低的破骨相关基因（TRAP, RANK, NFATC-1, MMP9, CTSK）表达水平。这表明该支架既能通过AL的持续释放促进成骨，又能有效抑制破骨细胞的分化和活性。

3.5. 骨质疏松大鼠体内的骨再生

通过卵巢切除（OVX）法成功建立骨质疏松大鼠模型。将支架植入大鼠股骨缺损处7天后，免疫荧光和免疫组化分析显示，TCP-PDA/AL-IL-4支架植入区有更多的M2型巨噬细胞（CD206⁺, Arg-1⁺）和更少的M1型巨噬细胞（iNOS⁺），证实了其体内免疫调节能力。植入6周后，Micro-CT三维重建和骨参数分析表明，TCP-PDA/AL-IL-4组的新骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）最高，骨小梁分离度（Tb.Sp）最低。H&E和Masson染色显示该组有更多且更成熟的新骨形成。双荧光标记（钙黄绿素和二甲酚橙）显示TCP-PDA/AL-IL-4组的矿物沉积率（MAR）最高。TRAP染色显示该组破骨细胞数量最少。这些体内实验结果充分证明了TCP-PDA/AL-IL-4支架在骨质疏松环境下卓越的促骨再生能力。

综上所述，本研究成功构建了一种具有时序调控免疫-成骨功能的生物陶瓷支架。该支架通过早期快速释放IL-4调控巨噬细胞极化，改善骨免疫微环境；后期持续释放AL，协同促进成骨分化并抑制破骨活性。这种仿生的时序调控策略，有效克服了骨质疏松环境下骨再生的障碍，在骨质疏松性骨缺损修复中展现出巨大的应用潜力。该研究不仅为开发用于病理环境下的智能骨修复材料提供了新思路，也深化了人们对骨免疫调节与骨再生之间复杂相互作用的理解。