可调控气凝胶支架通过孔隙结构与力学特性促进运动神经元前体分化修复脊髓损伤

《Materials Today Bio》：Aerogel library with varying porous structures and mechanics regulates motor neuron progenitor differentiation for spinal cord injury repair

本研究针对脊髓损伤修复中运动神经元前体（MNPs）定向分化调控难题，构建了具有梯度孔径（0-100 μm）和模量（0-3 kPa）的明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）气凝胶库，发现小孔径（25 μm）低模量（0.4 kPa）材料通过YAP信号通路显著促进MNPs向胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性运动神经元分化，并通过动物实验验证其修复效果，为神经支架材料设计提供了理论依据。

　　

脊髓损伤（SCI）是一种毁灭性的神经系统疾病，通常导致神经元不可逆性损伤和运动功能丧失。虽然干细胞移植为脊髓修复带来了希望，但移植后细胞在损伤微环境中容易发生去分化或非目标方向分化，严重影响治疗效果。近年来，生物材料的物理特性（如孔隙结构和力学性能）已被证明对干细胞分化具有重要调控作用，然而材料如何特异性调控运动神经元前体（MNPs）分化的具体规律仍不明确。

针对这一挑战，华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科团队在《Materials Today Bio》上发表研究，通过构建具有梯度孔径和模量的气凝胶材料库，系统揭示了材料物理特性对MNPs分化的调控规律。研究人员采用甲基丙烯酰胺修饰明胶（GelMA）为主要基质，通过添加不同比例的水溶性牺牲材料（如胶原、壳聚糖、PEG等），基于"二元协同互补"原理制备了孔径范围0-100 μm、模量范围0-3 kPa的气凝胶库。利用自主研发的"益气"气体-液体交换技术实现细胞均匀植入，通过体外细胞实验和脊髓损伤小鼠模型，证实了小孔径（25 μm）低模量（0.4 kPa）材料最能促进MNPs向胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性运动神经元分化。

关键技术方法包括：气凝胶库的构建与表征（扫描电镜、力学测试）、诱导多能干细胞（iPSCs）来源MNPs的诱导分化、"益气"细胞植入技术、免疫荧光染色与qPCR分析、脊髓损伤小鼠模型的行为学（BMS评分、步态分析、开阔场测试）和电生理评估。实验所用iPSCs来自广州干细胞库（伦理批号GIBH-IRB2019-032），动物实验获得相关伦理委员会批准（批准号N2019066）。

3.1. 气凝胶库的构建与表征

研究成功构建了孔径和模量可精确调控的气凝胶平台。通过添加不同牺牲材料改变冰晶形成过程，实现了孔径0-100 μm、模量0-3 kPa的梯度调控。FTIR光谱证实牺牲材料可完全洗脱，批次间变异系数（CV）小于15%，表明制备工艺稳定可靠。

3.2. MNPs植入与生物相容性

FDA/PI染色和CCK-8实验证明气凝胶具有良好的生物相容性。创新的"益气"技术通过气体-液体交换实现了细胞在支架内的均匀分布，避免了传统自上而下策略导致的细胞聚集问题。此外，研究还展示了3D打印技术制备复杂拓扑结构气凝胶的能力。

3.3. 体外评估气凝胶结构对MNP分化的影响

选择P25M0.4、P50M0.4、P70M0.4、P25M0.6和P25M1等代表性组别进行研究。免疫荧光染色显示，随着孔径减小和模量降低，ChAT阳性运动神经元数量显著增加，而Olig2阳性MNPs数量相应减少。在诱导培养基中，P25M0.4组的ChAT阳性细胞比例最高，且3D培养效果明显优于2D培养。

细胞骨架与机制研究

细胞骨架染色发现，P25M0.4组的肌动蛋白纤维更细长分散，符合神经元分化特征。Yes相关蛋白（YAP）定位分析表明，低模量材料中YAP主要定位于细胞质，而高模量材料中YAP发生核转位。使用ROCK抑制剂Y27632处理后，不同模量组间的分化差异消失，证实YAP信号通路在力学信号传导中的关键作用。YAP基因敲低实验进一步验证了这一机制。

3.4. 小鼠脊髓损伤模型的体内研究

在免疫缺陷（NSG）小鼠脊髓损伤模型中，植入细胞负载气凝胶3个月后，P25M0.4组在BMS运动评分、步态分析、开阔场测试等方面表现最佳。电生理评估显示该组运动诱发电位（MEP）振幅最高、潜伏期最短。组织学分析证实P25M0.4组损伤区域形成有序的线性结构，ChAT阳性细胞数量最多，MAP2阳性神经元纤维长度最长，表明运动神经元成熟度最高。

研究还通过hNA（人核抗原）染色追踪移植细胞命运，发现P25M0.4组中分化的ChAT阳性细胞主要来源于移植的人源MNPs，而其他组别存在较多未分化细胞。MNX1和Tuj1染色表明，P25M0.4组细胞分化进程更为顺利，较少停留在中间状态。

该研究首次系统阐明了材料物理特性对MNPs分化的调控规律，证实小孔径低模量环境通过细胞骨架-YAP信号通路促进运动神经元分化。所构建的气凝胶平台不仅为神经组织工程提供了可定制化材料解决方案，"益气"植入技术也为三维细胞培养提供了新思路。研究结果对脊髓损伤临床治疗具有重要指导意义，为设计智能化神经修复材料奠定了理论基础。未来需要在更大动物模型中进行验证，并探索更宽范围的物理参数对神经分化的影响。