帕比司特纳米递送系统通过诱导细胞周期阻滞和凋亡抑制小鼠肝癌生长

《Materials Today Bio》：Nanodelivery of panobinostat induces cell cycle arrest and apoptosis to suppress hepatocellular carcinoma growth in mice

本研究针对肝癌治疗中组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司特(PANO)存在的体内递送障碍问题，开发了叶酸靶向的PLGA-PEG-FA纳米载药系统。结果表明，该靶向纳米制剂(T-NP.PANO)可显著延长药物半衰期、增强肿瘤靶向性，通过上调p16/p21表达诱导G0/G1期阻滞，调控Bcl-2/Bax平衡激活Caspase通路引发凋亡，在原位肝癌小鼠模型中实现肿瘤消退和生存期延长，为肝癌靶向治疗提供了新策略。

　　

肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)作为原发性肝癌的主要亚型，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管小分子抑制剂在肿瘤治疗中展现出潜力，但大多数肝癌患者仍因反应率不理想和严重全身毒性而无法治愈。组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases, HDACs)在癌症细胞中过度表达，通过表观遗传沉默肿瘤抑制基因促进肿瘤发生。帕比司特(Panobinostat, PANO)作为一种有效的HDAC小分子抑制剂，已在血液系统恶性肿瘤中建立临床疗效，但其在实体瘤（如肝癌）中的临床应用受到体内递送障碍的显著限制。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，研究人员开发了一种创新的纳米递送策略，以克服PANO在肝癌治疗中的递送挑战。该研究首次证实了PANO纳米制剂在肝癌治疗中的有效性，为这一临床难题提供了新的解决方案。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过"油包水"单乳液法制备纳米制剂，利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)和马尔文粒度仪进行理化表征，采用CCK-8法评估细胞毒性，流式细胞术分析细胞周期和凋亡，蛋白质印迹法(Western blotting)检测相关蛋白表达，并建立H22-luc原位移植瘤小鼠模型进行体内疗效评价。

3.1. 帕比司特诱导的细胞周期阻滞和凋亡

研究首先证实PANO对小鼠H22和人HepG2肝癌细胞系的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为9和9.4 nmol/L。流式细胞术结果显示，PANO处理显著诱导G0/G1期阻滞（H22细胞24小时达79%），同时S期细胞比例显著减少。Western blotting分析显示PANO显著上调p16和p21蛋白表达，这些肿瘤抑制蛋白通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶发挥细胞增殖抑制作用。

在凋亡方面，PANO处理显著触发细胞凋亡（H22细胞24小时达37%），并伴随Bcl-2表达下调和Bax表达上调，同时激活Caspase-3和Caspase-9。Bcl-2和Bax分别作为抗凋亡和促凋亡因子发挥拮抗作用，而Caspase-3和Caspase-9是Bcl-2/Bax下游的重要促凋亡分子。这些发现表明PANO可通过表观遗传重编程触发癌细胞周期阻滞和凋亡，展示其在肝癌靶向治疗中的潜力。

3.2. 靶向纳米制剂的理化特性

研究人员采用"油包水"单乳液法制备了叶酸靶向的PEG化PANO负载纳米粒(T-NP.PANO)。该制剂呈球形纳米结构，包封率为82%，载药量为7%，粒径为159 nm，聚合物分散指数(PDI)为0.192，表面电荷为-5 mV。制剂在4°C储存7天或冻干复溶后粒径无显著变化，表现出良好的稳定性。

值得注意的是，T-NP.PANO显示出pH敏感性药物释放特性：在酸性条件(pH 5.5)下24小时释放93%的药物，而在中性条件(pH 7.4)下仅释放35%。这种特性归因于PLGA在酸性环境中的降解加速，有利于药物在肿瘤微酸性环境中的特异性释放。

3.3. 靶向纳米制剂的体外抗肝癌效果

细胞摄取实验表明，T-NP.PANO在FR高表达的H22细胞中的摄取显著高于非靶向制剂(NP.PANO)。竞争性抑制实验进一步证实了这一摄取机制是通过叶酸-叶酸受体(Folate-Folate Receptor, FA-FR)介导的内吞途径实现的。

在抗肿瘤效果方面，T-NP.PANO表现出最强的细胞生长抑制能力（细胞存活率30%），显著优于游离PANO（61%）和NP.PANO（44%）。机制研究表明，T-NP.PANO处理导致G0/G1期细胞比例显著增加（87%），并诱导最高水平的细胞凋亡（61%）。Western blotting结果证实T-NP.PANO能最有效地上调p16/p21表达，调控Bcl-2/Bax平衡，并激活Caspase通路。

3.4. 靶向纳米制剂的体内毒性、半衰期和组织分布

安全性评价显示，游离PANO（15 mg/kg）可引起健康小鼠体重显著减轻，而相同剂量的T-NP.PANO未引起明显毒性反应。组织病理学和血液学分析进一步证实T-NP.PANO具有良好的生物相容性，未引起血液、肝脏和肾脏毒性。

药代动力学研究表明，T-NP.PANO显著延长了PANO的血液循环半衰期（t_1/2 = 1.7小时），而游离PANO的半衰期仅为0.4小时。组织分布实验显示，T-NP.PANO能特异性蓄积在肝癌组织中，表明叶酸靶向修饰能有效克服PEG化可能带来的靶向性降低问题。

3.5. 靶向纳米制剂的体内治疗效果

在原位肝癌小鼠模型中，T-NP.PANO表现出最强的抗肿瘤效果，显著抑制肿瘤生长并延长动物生存期。治疗组中4/8的小鼠生存期超过60天，而PBS组、游离PANO组和NP.PANO组的中位生存期分别为16、21和26天。肿瘤组织Western blotting分析证实，T-NP.PANO能最有效地调控细胞周期和凋亡相关蛋白表达，与体外实验结果一致。

该研究通过合理设计的纳米递送系统，成功克服了PANO在肝癌治疗中的递送障碍。PLGA-PEG-FA纳米粒不仅提高了药物的溶解性和稳定性，还通过叶酸靶向实现了肝癌细胞的特异性识别和内化。pH敏感性释放特性进一步确保了药物在肿瘤微环境中的高效释放。

研究结果表明，靶向纳米递送策略能显著增强PANO的抗肝癌效果，同时降低系统毒性。这一 approach 不仅为PANO的肝癌临床应用提供了新思路，也为其他HDAC抑制剂的肿瘤靶向治疗提供了参考。未来研究可进一步探索该纳米平台与其他治疗 modalities（如化疗、放疗或免疫治疗）的联合应用，以期实现更有效的肝癌治疗策略。

值得注意的是，该研究仍存在一些局限性，如动物模型的临床相关性有待进一步提高，给药方案和剂量优化需要更系统研究。此外，纳米制剂的大规模生产和质量控制也是未来临床转化需要解决的关键问题。尽管如此，这项研究为肝癌的靶向治疗提供了有价值的实验依据，展示了纳米技术在克服药物递送障碍方面的巨大潜力。