用于定量活细胞中药物与微管亲和力的细胞穿透肽递送荧光探针

《Microchemical Journal》：Cell-penetrating peptide-delivered fluorescent probes for quantifying drug-microtubule affinity in living cells

精准量化活细胞中药物-靶标结合亲和力对药物研发至关重要。本研究创新性地开发了细胞穿透肽递送的荧光探针结合 assay（CPP-FPBA），以微管蛋白这一癌症治疗核心靶点为模型，通过荧光强度衰减动态监测药物竞争结合过程，成功建立了活细胞内药物-靶标结合亲和力的定量检测体系。实验表明该技术可同步识别正构和异构调控剂，显著优于传统单靶点分析方法。通过系统评估10种紫杉烷类药物在活细胞中的结合特性，发现cabazitaxel和cephalomannine的Kd值与体外实验存在显著差异，证实了传统体外模型与真实细胞环境的差异，为抗癌药物优化提供了新范式。

　　药物与靶点结合亲和力的准确量化在药物研发中至关重要。传统的体外实验方法，如使用重组蛋白进行检测，往往无法反映天然蛋白的状态或细胞内的复杂环境，导致亲和力测定结果不够准确。而在活细胞中，蛋白质会经历多种修饰，并与其他分子形成复合物，因此药物的行为不仅受到非靶点相互作用的影响，还可能与内源性分子竞争，或受到代谢和运输过程的调节。因此，开发能够在天然细胞环境中准确评估药物与靶点结合的方法，对于药物研发具有重要意义。

近年来，基于细胞的实验方法逐渐成为研究药物与靶点相互作用的重要工具，显著提高了我们对药物结合亲和力的理解。尽管这些方法在研究药物与靶点的结合时具有更高的生理相关性，但现有的细胞内研究手段仍然存在一定的局限性。例如，热移位实验需要不自然的高温环境，而荧光蛋白标记则需要基因改造，这些操作可能会影响靶点的天然功能，从而影响亲和力的测定。相比之下，靶向荧光探针通过将荧光染料与已知配体结合，已成为在活细胞中评估药物与靶点结合亲和力的敏感工具，且对靶点的天然功能影响较小。目前大多数研究主要集中在细胞表面靶点，如GABA受体和AMPK，取得了可靠的定量数据。然而，对细胞内靶点的定量分析，特别是考虑到细胞内靶点约占整个蛋白质组的75%，仍然是一个重大挑战。

这种挑战主要源于靶向探针经过修饰后的分子尺寸和极性增加，进一步限制了膜渗透性，从而阻碍了其在细胞内研究中的应用。因此，有效的策略对于克服靶向探针的膜渗透性问题，实现对细胞内靶点的可靠监测至关重要。为了应对这一问题，研究人员已经开发了多种方法，以促进对细胞内蛋白靶点的药物结合研究。尽管化学修饰，如添加疏水基团或掩蔽基团，可以产生具有细胞渗透性的探针，但这些修饰通常需要详细的结构信息指导下的反复合成，过程较为繁琐且技术要求高，因此限制了对更广泛靶点药物结合的高效研究。相比之下，细胞穿透肽（CPPs）作为一种由5至30个氨基酸组成的短序列，为细胞内递送提供了一种简便而高效的方式。CPPs已经被广泛用于递送蛋白质、小分子药物或探针，以实现治疗、诊断和成像的目的。然而，要准确评估药物与靶点的结合亲和力，不仅需要高效的探针递送以实现特定靶点的标记，还需要探针能够产生可靠的荧光信号，以响应药物的结合并实现精确的定量分析。

为此，我们开发了一种新的基于细胞穿透肽递送的荧光探针结合实验方法（CPP-FPBA），利用MixLPV介导的递送方式，使原本无法渗透细胞膜的探针能够在活细胞中实现精确的药物靶点结合分析。我们以微管作为模型，因为微管是癌症治疗中的关键靶点，具有多个临床相关的结合位点，包括紫杉烷、秋水仙碱和长春碱位点。研究表明，紫杉烷类药物在多种癌症治疗中发挥重要作用，并在骨肉瘤细胞中表现出显著的疗效。因此，我们选择紫杉烷作为研究对象，并利用U2OS，一种广泛用于骨肉瘤研究的细胞系，来建立一个完整的实验体系。通过CPP-FPBA，我们不仅能够有效测定药物与靶点的解离常数（Kd），还能够从小分子库中筛选出正向和反向调节剂，捕捉传统单靶点分析可能忽略的潜在协同调节效应。

此外，我们还成功对10种筛选出的紫杉烷类药物进行了统一的活细胞结合亲和力分析，这些药物靶向微管上广泛用于临床的紫杉烷结合位点。这一分析提供了前所未有的详细信息，使得不同药物之间的结合亲和力可以进行精确比较。值得注意的是，两种具有前景的微管靶向抗癌药物，卡巴他赛和头孢曼尼，其在活细胞中的Kd值与体外测量结果存在显著差异。这一发现突显了体外预测与实际细胞效果之间的差距，强调了在活细胞中进行定量分析的必要性。CPP-FPBA不仅克服了传统方法的局限性，还能够在生理条件下实现对细胞内蛋白结合亲和力的定量分析，为药物机制研究和药物开发提供了强有力的支持。

在实验过程中，我们采用了化学合成的方法制备了具有荧光标记的微管探针。具体而言，我们按照之前报道的方法合成Tubulin-Atto 488，其中Docetaxel作为识别微管的配体部分，被修饰在其3′-氨基上，连接了一个氨基己酸链接器。链接器的末端氨基与Atto 488的NHS酯进行偶联，最终得到了用于微管靶向的荧光探针。这种探针能够在细胞内实现有效的标记，同时保持对靶点天然功能的最小干扰。

在细胞培养方面，我们使用了人骨肉瘤细胞系U2OS，这些细胞在 McCoy's 5A 培养基中生长，培养基中添加了必要的生长因子和营养物质。为了确保实验的准确性和可重复性，我们采用了标准化的细胞培养流程，并对细胞的生长状态进行了密切监控。通过这一流程，我们能够获得高质量的细胞样本，为后续的实验分析提供基础。

在实验设计中，我们采用了CPP-FPBA方法，以评估药物与微管的结合亲和力。通过这一方法，我们能够观察到药物与荧光探针之间的竞争效应，从而实现对Kd值的测定。这种竞争效应表现为荧光强度的下降，我们通过精确的荧光测量技术能够捕捉这一变化，并进行定量分析。此外，CPP-FPBA方法还能够同时识别正向和反向调节剂，这对于理解药物在细胞内的作用机制具有重要意义。通过这一方法，我们能够获得药物与靶点之间更为全面的相互作用信息，而不仅仅是单一的结合事件。

在实验结果中，我们对10种紫杉烷类药物进行了详细的分析，这些药物均靶向微管上的紫杉烷结合位点。我们发现，这些药物在活细胞中的结合亲和力与体外实验结果存在显著差异，这表明在细胞内进行药物结合研究的重要性。通过CPP-FPBA方法，我们能够更准确地评估药物在活细胞中的实际效果，从而为药物优化和机制研究提供可靠的数据支持。此外，我们还发现，卡巴他赛和头孢曼尼在活细胞中的Kd值与体外测量结果存在明显不同，这进一步证明了CPP-FPBA方法在药物研究中的价值。

总的来说，CPP-FPBA方法为药物与靶点结合研究提供了一种新的思路和工具。通过利用细胞穿透肽实现探针的细胞内递送，我们能够克服传统方法在膜渗透性和细胞环境适应性方面的不足。这一方法不仅能够在生理条件下实现对药物结合亲和力的准确测定，还能够捕捉药物与靶点之间更为复杂的相互作用，包括正向和反向调节效应。这些发现为药物研发提供了重要的支持，同时也为未来的药物机制研究和药物筛选提供了新的方向。通过进一步优化CPP-FPBA方法，我们相信能够实现更广泛药物靶点的结合研究，从而推动药物开发的进程。