一种创新的、针对AQP4循环C结构域的单克隆抗体能够降低补体依赖性的细胞毒性，并减轻实验性视神经脊髓炎的病情

《Multiple Sclerosis and Related Disorders》：An innovative AQP4 loop C-targeted monoclonal antibody reduces complement-dependent cytotoxicity and lessens experimental neuromyelitis optica

神经炎 optica谱病（NMOSD）由靶向水通道蛋白4（AQP4）胞外域的单克隆抗体（NMO-IgG）引发，导致神经炎症和髓鞘破坏。本研究成功开发出针对AQP4 ECD环C的单抗A001，证实其能阻断NMO-IgG结合、抑制补体依赖性细胞毒性（CDC），并减轻小鼠模型中的NMOSD病理。

　　

王凯辰|王兰婉|陈启民|陈志文|林谷俊|陈立腾|胡志芬|Sytwu Huey-Kang|陈世舟

台湾国立阳明大学医学院成新综合医院神经科

摘要

视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种神经炎症性疾病，由针对星形胶质细胞水通道蛋白aquaporin-4（AQP4）胞外域（ECD）的自身抗体引起（AQP4-IgG或NMO-IgG）。AQP4-IgG的产生导致AQP4功能丧失，通过补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性破坏星形胶质细胞，并随后引发神经损伤。因此，阻止NMO-IgG与AQP4的结合可能成为治疗NMOSD的一种可行策略。在本研究中，我们制备了一种针对AQP4 ECD环C区段的单克隆抗体（命名为A001）。我们检测了其与AQP4的结合亲和力，以及其防止NMO-IgG与AQP4结合、抑制培养中的CDC反应以及在小鼠模型中减轻NMOSD样病理的能力。荧光标记的A001在过表达AQP4的HEK293细胞中的染色模式与荧光标记的NMO-IgG的染色模式重叠。预先孵育或同时孵育A001能有效阻断NMO-IgG的免疫染色。此外，在人或小鼠补体存在的情况下，A001还能抑制NMO-IgG对过表达AQP4的HEK293细胞的损伤。鞘内注射A001也能减轻NMO-IgG诱导的小鼠NMOSD模型中的视神经和脊髓脱髓鞘及免疫细胞浸润。使用针对ECD肽段的抗体竞争性阻断自身抗体与AQP4的结合，可能是治疗NMOSD的一种有前景的策略。

章节摘录

背景

视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）是一种中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，通常呈复发性疾病过程，最终可能导致视力障碍或失明。血清中的免疫球蛋白G自身抗体（NMO-IgG）已被确定为NMOSD的特异性标志物，并在NMOSD患者中频繁检测到（Lucchinetti, 2002; Lennon, 2004; Weinshenker & Wingerchuk, 2008）。因此，NMO-IgG（或AQP4-IgG）被认为是驱动NMOSD的主要致病因子。

AQP4结构

人类AQP4（P55087）和小鼠AQP4（P55088）的蛋白质序列来自UniProt（“2025年通用蛋白质知识库”，2025年），其三维结构使用Cn3D软件生成（https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/cn3d/Cn3D-4.3.msi）。

实验动物

6-8周龄的雌性C57BL/6J（B6）小鼠购自国家应用研究实验室的国家实验动物中心，并在国防医疗中心（NDMC）的实验动物中心进行繁殖。

mAQP4环C肽段特异性多克隆抗体的制备与分离

基于mAQP4的拓扑模型，Owen及其同事预测mAQP4环C肽段可能是NMO-IgG/AQP4-IgG的免疫原（Owens等人，2015年）。使用Cn3D软件分析人类和小鼠mAQP4环C肽段的序列和三维构象后发现它们具有高度同源性，仅第149个氨基酸不同（hAQP4环C为甲硫氨酸，mAQP4环C为苏氨酸）（Lu等人，1996年；Zelenin等人，2000年）。hAQP4和mAQP4的表位确认结果也相当。

讨论

Aquaporin-4是中枢神经系统中的主要水通道蛋白，主要由胶质细胞（尤其是星形胶质细胞）表达，通过称为OAPs的超分子聚集体调节血脑屏障（BBB）的水分通透性。这些OAPs也具有高密度的自身抗体表位，因此是NMOSD的主要致病因素（Neely等人，1999年）。已鉴定出两种AQP4亚型：一种长323个氨基酸的亚型，翻译起始位点为Met-1，称为M-1型；另一种较短，长301个氨基酸。

结论

我们成功制备了一种针对mAQP4环C肽段的单克隆抗体（A001），其与AQP4的结合亲和力高于NMO-IgG，这通过阻断hAQP4过表达的HEK293细胞中NMO-IgG的结合得到证实。此外，A001在人或小鼠补体存在的情况下有效保护了hAQP4过表达的HEK293细胞免受NMO-IgG诱导的CDC损伤。进一步地，A001还防止了NMO-IgG诱导的小鼠NMOSD模型中的脊髓和视神经炎症。因此，这种mAQP4环C肽段特异性抗体可能是治疗NMOSD的有效策略。

缩写列表

ADCC：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

BSA：牛血清白蛋白

CDC：补体依赖性细胞毒性

CFA：完全弗氏佐剂

CNS：中枢神经系统

FBS：胎牛血清

FDA：美国食品药品监督管理局

MAC：膜攻击复合物

MOG：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白

NDMC：国防医疗中心

NSC：国家科学委员会

OAP：正交粒子阵列

PBS：磷酸盐缓冲盐水

PBST：含有Triton的PBS

RT：室温

伦理批准与参与同意

所有动物实验均获得了台湾国防医科大学（IACUC-16263）、三军总医院（TSGH-108-2-05-003）和成新综合医院（CHGH-IRB 112B-12）的批准。

出版同意

不适用

资助

本研究得到了台湾国家科学委员会（NSC）、成新综合医院、三军总医院、国防医疗中心（台北）和 Chi Mei 医疗中心（台南）的资助，资助项目包括MOST111-2314-B-016-042-MY3、CH-NDMC-111-8、TSGH-C02-112028、MND-MAB-110-137、NSTC 114-2314-B-016-009 -MY3 和 CMNDMC11013TSGH-C03-113036。

数据获取

支持本研究结论的原始数据可应要求向相应作者索取。

未引用的参考文献

Hinson等人，2007年；Huang等人，2016年；Lachmann，2010年；Lennon等人，2004年；Lucchinetti等人，2002年；Miyazaki-Komine等人，2015年；Spitz等人，1984年；Tradtrantip等人，2021年；Carnero Contentti和Correale，2021年；Chin等人，1994年

CRediT作者贡献声明

王凯辰：撰写——初稿，资源整理。王兰婉：撰写——审阅与编辑，方法学设计。陈启民：方法学设计，数据管理。陈志文：软件使用，数据分析。林谷俊：数据可视化，验证。陈立腾：方法学设计，数据管理。胡志芬：数据可视化，实验研究。Sytwu Huey-Kang：指导，概念构思。陈世舟：数据可视化，验证，指导，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢Huey-Jane Lee教授在hAQP4和mAQP4的三维结构研究方面的工作，以及台湾国家实验动物中心（NLAC）和NARLabs在病理分析方面提供的技术支持。