Colletotrichum fructicola 的 Cfα1tub、Cfα2tub、Cfβ1tub 和 Cfβ2tub 在调控 carbendazim 敏感性方面的功能差异

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Functional divergence of Cfα1tub, Cfα2tub, Cfβ1tub and Cfβ2tub of Colletotrichum fructicola in regulation of carbendazim sensitivity

茶油树炭疽病菌（Colletotrichum fructicola）α/β微管异构体与甲霜灵（MBC）的互作机制及耐药性研究，通过基因敲除发现Cfβ2tub缺失突变体高耐药性源于Cfβ1tub表达上调，且MBC诱导Cfβ1tub和Cfα2tub蛋白降解，与F. graminearum不同。

　　茶油树（*Camellia oleifera* Abel.）是中国重要的木本油料作物，其果实可以产出优质的食用油，对人类健康具有显著益处。然而，茶油树容易受到炭疽病的侵害，这是一种严重的病害，能够感染茶油树的叶片和果实，从而降低茶油的质量和产量。研究表明，炭疽病主要由多种*Colletotrichum*真菌引起，其中*Colletotrichum fructicola*是主要致病菌，因其在茶油树上的分离率和致病性最高。此外，*C. fructicola*也会感染苹果、梨、桃等多种水果，造成重大经济损失。

为了控制*Colletotrichum fructicola*，人们主要依赖化学杀菌剂，如卡本达唑（carbendazim，简称MBC），这是一种常见的苯并咪唑类杀菌剂。MBC通过与α?/β-微管蛋白异二聚体结合，干扰微管的形成和动态变化，从而抑制多种植物病原真菌的极性生长。因此，MBC属于微管稳定剂（MDAs）的一种。研究表明，大多数植物病原真菌或模式真菌都具有多种α-和β-微管蛋白亚型，例如*Botrytis cinerea*具有三种α-和一种β-微管蛋白；*Colletotrichum gloeosporioides*含有两种α-（Cgα1tub和Cgα2tub）和两种β-微管蛋白（Cgtub1和Cgtub2）；*Fusarium graminearum*具有两种α-（Fgα1tub和Fgα2tub）和两种β-微管蛋白（Fgβ1tub和Fgβ2tub）；*Aspergillus nidulans*表达两种α-（AnTubA和AnTubB）和两种β-微管蛋白（AnBenA和AnTubC）；*Saccharomyces cerevisiae*表达两种α-（ScTub1和ScTub3）和一种β-微管蛋白（ScTub2）；*Saccharomyces pombe*则表达两种α-（SpNda2和SpAtb2）和一种β-微管蛋白（SpNda3）。这些不同的微管蛋白亚型在调控MDAs敏感性方面表现出差异性，例如*F. graminearum*的Fgα1tub、Fgα2tub和Fgβ2tub缺失突变体对MBC表现出超敏感性，而Fgβ1tub缺失突变体则表现出轻微的敏感性下降。此外，在*Aspergillus nidulans*中，仅表达tubC（即AnbenA基因的编码序列被替换成AntubC）的突变体也表现出对苯菌灵（benomyl，MBC的前体）的超敏感性。这些现象表明，不同β-微管蛋白亚型在调控MBC敏感性方面具有独特的功能。

在*Colletotrichum fructicola*中，先前研究已经鉴定出两个β-微管蛋白基因，即*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*。其中，*Cfβ2tub*缺失突变体（*Cf*Δ*β2tub*）相较于*Cfβ1tub*缺失突变体表现出更严重的生长、形态、分生孢子形成和致病性缺陷。同时，田间分离株中表现出对MBC抗性的突变体也仅在*Cfβ2tub*中被发现。值得注意的是，*Cf*Δ*β2tub*对MBC表现出高度抗性，这与*F. graminearum*的Fg*β2tub*缺失突变体（FgΔ*β2tub*）表现出的抗性不同，尽管FgΔ*β2tub*同样表现出严重的生长和形态缺陷。这一现象提示，*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*对MBC的响应可能存在功能上的分化，但这种分化尚未被充分理解。

β-微管蛋白主要以α?/β-微管蛋白异二聚体的形式存在，但*Colletotrichum fructicola*的α-微管蛋白亚型尚未被完全表征，这限制了对*Colletotrichum fructicola*微管蛋白及其相关靶向药物开发的研究。因此，本研究的目的是：（1）鉴定并表征*Colletotrichum fructicola*的α-微管蛋白亚型；（2）研究α-和β-微管蛋白亚型之间的相互作用模式；（3）分析α-和β-微管蛋白亚型在野生型菌株以及*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*缺失突变体中对MBC的响应情况。这些研究结果将有助于理解MDAs与真菌α?/β-微管蛋白之间的相互作用机制，并为开发新的靶向微管蛋白的杀菌剂提供理论支持。

本研究首先通过生物信息学方法在*Colletotrichum fructicola*的基因组中鉴定了两个α-微管蛋白基因，即*Cfα1tub*和*Cfα2tub*。这两个基因分别编码454个和450个氨基酸的α-微管蛋白，彼此之间具有69.5%的同源性。*Cfα1tub*与其它物种的α-微管蛋白具有60%至90%的同源性，其中与*F. graminearum*的Fgα2tub（92.1%）同源性最高。而*Cfα2tub*与其它α-微管蛋白的同源性范围为70%至90%，其中与Fgα1tub（94.4%）的同源性最高。为了进一步研究这些α-微管蛋白亚型的功能，我们构建了相应的缺失突变体，并通过表型分析和分子生物学手段评估其对生长、形态、分生孢子形成和致病性的影响。

实验结果显示，*Cfα1tub*和*Cfα2tub*的缺失突变体在生长和形态方面表现出不同程度的缺陷，这表明这两个α-微管蛋白亚型在维持菌体正常结构和功能中具有重要作用。同时，我们发现*Cfβ2tub*的缺失会导致*Cfβ1tub*的表达水平显著升高，这可能与*Cfβ2tub*在调控*Cfβ1tub*表达中的作用有关。此外，在无MBC的条件下，*Cfα2tub*和*Cfβ2tub*的蛋白水平高于*Cfα1tub*和*Cfβ1tub*，而在存在MBC的情况下，这些蛋白会被26S蛋白酶体降解。这一现象提示，MBC对微管蛋白的调控可能涉及特定的降解机制。

进一步分析表明，*Cfβ1tub*的过表达突变体对MBC表现出较低的敏感性，而*Cfβ2tub*的缺失突变体（*Cf*Δ*β2tub*）则表现出高度抗性。这一抗性不仅与*Cfβ1tub*的高表达有关，还可能与*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*异二聚体对MBC的结合能力不同有关。尽管*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*异二聚体对MBC的结合亲和力相似，但*Cfβ1tub*的过表达突变体表现出对MBC的较低敏感性，这可能意味着*Cfβ1tub*在某些情况下能够抵抗MBC的作用。此外，*Cfβ1tub*的表达水平在*Fgβ2tub*缺失突变体中显著升高，而*Cfβ2tub*的缺失并未显著影响*Cfβ1tub*的表达水平，这表明*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*在某些情况下可能相互调控。

研究还发现，尽管*Cfα2tub*的蛋白水平在*Fg*Δ*β2tub*中较低，但在存在MBC的情况下，*Cfα2tub*的降解可以被缓解，这可能意味着*Cfα2tub*在MBC处理下具有一定的稳定性。这种稳定性可能与*Cfα2tub*的结构特性有关，或者与它与其他蛋白的相互作用有关。因此，*Cfα2tub*和*Cfβ2tub*在MBC处理下的响应可能存在差异，这种差异可能影响它们对杀菌剂的敏感性。

此外，研究还发现，在*Fg*Δ*β2tub*中，*Fgβ1tub*的表达水平升高，而*Cf*Δ*β2tub*中*Cfβ1tub*的表达水平也显著升高。这表明，β-微管蛋白亚型之间的相互作用可能在调控MBC敏感性方面发挥重要作用。同时，*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*异二聚体对MBC的结合能力相似，但*Cfβ1tub*的过表达突变体表现出对MBC的较低敏感性，这可能意味着*Cfβ1tub*在某些情况下能够抵抗MBC的作用。因此，*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*在调控MBC敏感性方面可能具有不同的功能，这种功能上的分化可能影响真菌对杀菌剂的反应。

综上所述，*C. fructicola*的α-和β-微管蛋白亚型在调控MBC敏感性方面表现出不同的功能，这种功能上的分化可能影响其对杀菌剂的反应。此外，*Cfβ1tub*和*Cfβ2tub*的表达模式在野生型菌株和缺失突变体中也有所不同，这可能意味着它们在真菌生长和致病性中的作用不同。这些发现不仅有助于理解*Colletotrichum fructicola*的微管蛋白调控机制，也为开发新的靶向微管蛋白的杀菌剂提供了理论依据。