改进非哺乳动物血浆中外泌囊泡的分离方法：通过调节渗透压来提高分离效率

《Research in Veterinary Science》：Improving extracellular vesicle isolation from non-mammalian blood plasma: Enhancing efficiency through adjusted osmolarity

本研究建立了一种标准化的外泌体（EVs）分离方法，通过调整缓冲液渗透压和超速离心技术，成功从鸡、蟒蛇、非洲爪蟾和鲤鱼四种非哺乳动物脊椎动物的血浆中分离出外泌体。结果表明，不同物种EVs的大小和浓度存在显著差异，其中鱼类EVs最大（163.6±5.38 nm），鸟类EVs浓度最高（1.25×1012±1.48×1011 particles/mL）。研究证实调整渗透压的缓冲液（aDPBS）可使EVs分离效率提升至86%，而未调整的缓冲液效率仅为21.1%。通过MEMGlow染色和透射电镜验证了EVs的膜完整性。该成果为跨物种EVs研究提供了方法学基础，并揭示了脊椎动物中EVs的演化特征。

　　近年来，随着对细胞间通讯机制研究的深入，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）因其在信息传递、免疫调节和疾病传播中的重要作用而受到广泛关注。EVs是由细胞分泌的膜包裹结构，能够在细胞间传递多种分子物质，如RNA、DNA、蛋白质和脂质，从而影响目标细胞的功能。尽管哺乳动物来源的EVs研究已经取得了显著进展，但非哺乳动物脊椎动物的EVs研究仍处于初级阶段，缺乏系统性和标准化的方法。本研究旨在填补这一空白，提出一种适用于多种非哺乳动物脊椎动物血浆中EVs分离的标准化方法，包括鸡、玉米蛇、非洲爪蟾和鲤鱼等代表性物种。这些物种分别属于鸟类、爬行类、两栖类和鱼类，涵盖了脊椎动物的多个类别，具有重要的进化研究价值。

EVs在不同物种中的存在和功能差异引起了科学界的极大兴趣。EVs不仅在哺乳动物中扮演重要角色，还在非哺乳动物脊椎动物中展现出类似的生物学特性。然而，由于这些物种的生理环境和细胞特性与哺乳动物存在差异，传统的EVs分离方法往往无法有效应用于非哺乳动物脊椎动物。因此，开发适用于不同物种的EVs分离和分析方法显得尤为重要。本研究采用了一种基于超速离心的通用分离方法，以期为非哺乳动物脊椎动物EVs的研究提供可靠的技术支持。

在实验设计中，研究者选择了四个不同类别的脊椎动物作为研究对象：鸡（Gallus gallus domesticus）、玉米蛇（Pantherophis guttatus）、非洲爪蟾（Xenopus laevis）和鲤鱼（Cyprinus carpio L.）。这些物种在进化上具有代表性，能够帮助科学家更好地理解EVs在不同生物体中的普遍性和多样性。通过采用超速离心法，研究团队成功地从这些物种的血浆中分离出EVs，并对其进行了详细的表征和分析。研究结果表明，调整缓冲液的渗透压对于提高EVs分离效率至关重要，特别是在鱼类和两栖类中，使用调整后的缓冲液能够显著提高EVs的纯度和回收率。

为了确保EVs的准确分离和表征，研究团队采用了多种技术手段。首先，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）测定EVs的大小和浓度。NTA技术能够提供关于EVs分布和数量的直观数据，但其分辨率有限，无法准确反映EVs的形态特征。因此，研究者还结合了透射电子显微镜（TEM）和MEMGlow染色技术，以进一步验证EVs的膜结构。TEM能够提供高分辨率的图像，帮助观察EVs的形态和结构，而MEMGlow作为一种脂溶性染料，能够特异性地标记膜包裹结构，从而提高检测的准确性。此外，研究团队还使用了Triton X-100处理样品，以破坏EVs的膜结构，从而评估其是否为真正的膜来源。

在EVs的表征过程中，研究者还采用了Western blot技术检测EVs的标志蛋白，如HSP70、CD9、Alix和TSG101。这些蛋白在EVs的分类和功能研究中具有重要意义。然而，由于非哺乳动物脊椎动物与哺乳动物在蛋白序列上的差异，某些标志蛋白在非哺乳动物中的检测可能存在挑战。例如，CD9在鲤鱼中的同源性仅为45%，这限制了其在EVs表征中的应用。相比之下，HSP70在所有研究物种中均显示出较高的同源性，且在Western blot分析中表现出一致的表达模式，这使其成为EVs研究中较为可靠的标志蛋白之一。

研究结果表明，不同物种的EVs在大小和浓度上存在显著差异。其中，鱼类和两栖类的EVs平均粒径较大，而鸟类和爬行类的EVs粒径较小。这种差异可能与不同物种的生理环境、细胞类型以及EVs的来源有关。此外，EVs的浓度在鸟类和爬行类中较高，而在鱼类和两栖类中相对较低。这些发现提示，EVs的特性可能受到物种特异性因素的影响，因此在研究不同物种的EVs时，需要考虑到这些差异。

在实际操作中，研究团队发现，调整缓冲液的渗透压是提高EVs分离效率的关键因素。例如，使用与人类样本相匹配的渗透压缓冲液时，EVs的分离效率显著下降，导致EVs的异质性和数量减少。这表明，非哺乳动物脊椎动物的体液特性与哺乳动物存在显著差异，因此在EVs分离过程中，必须根据目标物种的特点进行相应的调整。这种调整不仅提高了EVs的回收率，还增强了分离样品的纯度和一致性。

本研究还探讨了EVs在病毒传播中的潜在作用。已有研究表明，哺乳动物中的EVs能够携带病毒成分，从而在病毒传播过程中起到一定的作用。例如，HIV、流感病毒和SARS-CoV-2等病毒可以被EVs包裹，从而增强其感染能力。类似的现象可能也存在于非哺乳动物脊椎动物中，因此，EVs在病毒传播中的研究具有重要的科学意义。通过本研究的方法，科学家可以更有效地从非哺乳动物脊椎动物的体液中分离EVs，并进一步研究其在病毒传播中的功能。

此外，本研究还强调了EVs在进化研究中的重要性。由于EVs在不同物种中表现出相似的生物学功能，它们可能在进化过程中保留了某些保守的信号通路。通过比较不同物种的EVs特性，科学家可以更好地理解EVs在进化中的作用，以及它们在不同生物体中的适应性变化。这种比较研究不仅有助于揭示EVs的生物学功能，还可能为跨物种的疾病研究提供新的视角。

在实际应用方面，本研究提出的方法具有广泛的适用性和可操作性。该方法基于超速离心，不需要昂贵的设备或商业试剂，使得EVs的分离和研究更加便捷。这对于资源有限的研究机构和实验室尤为重要，因为传统的EVs分离方法往往依赖于特定的设备和试剂，成本较高。通过优化离心参数和缓冲液的渗透压，研究团队成功地提高了EVs的分离效率，为后续的免疫学和病毒学研究奠定了基础。

总体而言，本研究为非哺乳动物脊椎动物EVs的研究提供了一种标准化的方法，并揭示了不同物种EVs在大小、浓度和膜结构上的差异。这些发现不仅有助于深入理解EVs的生物学功能，还可能为跨物种的疾病研究和治疗策略提供新的思路。随着对EVs研究的不断深入，未来可能会有更多关于其在不同物种中的作用和机制的探索，从而推动相关领域的进一步发展。