基于CRISPR的合成生物学工具包在Candida viswanthii中的开发以及对响应压力的Ena1样蛋白的功能分析

《Systematic and Applied Microbiology》：CRISPR-based synthetic biology toolkit development in Candida viswanthii and functional analysis of the stress responsive Ena1-like protein

基因编辑工具箱在C. viswanathii中高效建立并用于g144功能解析，发现其不具Na+转运活性但影响碱性条件下的DDA合成。

　　在工业生物技术领域，酵母作为一种重要的微生物资源，被广泛应用于酶类、生物化学品和单细胞蛋白的生产。特别是*Candida*属酵母，因其在生物转化和可持续生物合成中的潜力，成为近年来研究的热点。然而，尽管*Candida*酵母在工业应用中展现出巨大前景，其基因编辑工具仍处于发展初期，这在很大程度上限制了其在基因工程和代谢工程中的应用。本研究旨在建立一种高效的基因组编辑策略，以克服*Candida viswanathii*（Cv310）基因编辑中的技术障碍，并进一步探索其在工业应用中的潜力。

*Candida viswanathii*作为一种非传统酵母，具有自然利用多种碳源的能力，包括脂肪酸衍生物和长链脂肪酸。这种特性使其在生物降解和生物合成方面具有独特优势。例如，Cv310已被用于生产脂肪酶和中长链二羧酸（如十二烷二酸，DDA），这些物质在工业材料制造中具有重要应用价值。随着对高性能材料（如尼龙和树脂）需求的增长，DDA的生物合成成为一种比传统石油化学合成更环保、可持续的替代方案。目前，已有企业如Cathay Biotech成功实现了基于工程*Candida*菌株的DDA工业化生产。然而，为了进一步提高生产效率和产品质量，需要更高效的基因编辑工具，以实现更精确的基因调控和多基因改造。

*Candida*属酵母在基因编辑方面面临诸多挑战。首先，许多*Candida*物种具有二倍体基因组，不经历减数分裂，这意味着每个等位基因都需要单独靶向，使得遗传操作变得复杂。其次，该属中的许多物种属于CTG密码子簇，其中CTG密码子被重新分配为编码丝氨酸而非亮氨酸。这种密码子表的差异可能导致外源基因表达时出现翻译错误或效率低下。最后，非同源末端连接（NHEJ）在*Candida*菌株中占据主导地位，而高效的同源重组修复（HDR）机制较为薄弱，这使得精确的基因编辑变得困难。因此，开发适用于*Candida*属的高效基因编辑系统成为亟需解决的问题。

目前，已有针对*C. albicans*、*C. parapsilosis*、*C. glycerinogenes*和*C. tropicalis*等*Candida*物种的基因编辑研究，主要采用传统的同源重组和CRISPR/Cas9技术。然而，对于*C. viswanathii*而言，其基因编辑效率相对较低，仅达到60%，且一次基因组整合只能容纳约13.6 kb的DNA片段。这种局限性不仅影响了基因工程的效率，也限制了其在多基因改造和多拷贝基因整合方面的应用。因此，本研究旨在开发一种结合CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统的高效基因组编辑策略，以解决上述问题。

本研究构建了一种基于CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统的基因编辑平台，显著提高了*C. viswanathii*的编辑效率。通过使用来自*C. albicans*的ARS序列和优化的启动子，研究团队设计了多种质粒，如pUC57-ARS-HygR和pUC57-ARS-NrsR，以实现基因表达和筛选标记的整合。此外，研究团队还构建了包含Cre重组酶的质粒，以实现标记的回收，从而提高编辑的灵活性和重复性。通过比较不同编辑策略的效率，研究发现基于HDR的基因编辑系统在*C. viswanathii*中具有更高的效率，可达83-100%。同时，研究还实现了多基因编辑和多拷贝基因整合，例如在rDNA位点成功整合了多达7个GFP拷贝，这为高通量基因工程和细胞工厂构建提供了重要基础。

为了进一步验证该基因编辑系统的有效性，研究团队对Cv310中一种类似Ena1的蛋白g144进行了功能分析。Ena1是*Saccharomyces cerevisiae*中一种重要的质膜蛋白，负责钠离子和碱性pH条件下的应激响应。然而，g144在*C. viswanathii*中表现出不同的特性。通过构建g144的缺失和过表达菌株，研究团队发现g144在DDA发酵过程中表现出显著的转录上调，但其本身并不具备钠离子转运活性。进一步的实验表明，g144的缺失和过表达菌株在碱性pH和高钠浓度条件下均表现出对碱性和钠离子胁迫的敏感性，且DDA产量显著下降。这提示g144可能在细胞应激响应中发挥重要作用，尽管其并非传统意义上的钠离子转运蛋白。

研究还发现，g144的缺失或过表达对DDA产量的影响主要与细胞对碱性环境和钠离子胁迫的应激反应有关。尽管Ena1在高钠浓度或碱性条件下会显著上调表达，而其缺失会导致细胞对钠离子和碱性pH的敏感性增加，但g144的缺失或过表达却导致了DDA产量的下降。这可能是因为g144在细胞膜应激信号整合和维持膜稳态方面具有特定的功能，其表达水平的变化可能影响了细胞对环境胁迫的适应能力，从而间接影响了DDA的合成效率。

本研究的成果不仅为*C. viswanathii*的基因编辑提供了新的工具，还为*Candida*属其他物种的基因工程应用奠定了基础。通过建立高效的基因组编辑系统，研究团队实现了快速、精确的多基因编辑和多拷贝基因整合，这将有助于进一步优化*C. viswanathii*的代谢途径，提高其在生物合成中的性能。此外，对g144的功能分析揭示了其在细胞应激响应中的潜在作用，为后续的功能基因组学研究提供了新的方向。

总的来说，本研究通过整合CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统，成功构建了一种高效的基因组编辑工具，显著提升了*C. viswanathii*的基因编辑效率。这一突破不仅为*Candida*属酵母的基因工程和代谢工程提供了新的可能性，还为实现可持续的生物制造提供了技术支持。未来，研究团队计划进一步优化该系统，例如通过增强同源重组能力或调整筛选标记的强度，以提高多基因编辑和多拷贝整合的效率。此外，对g144的深入研究可能揭示其在细胞应激响应中的具体机制，从而为相关生物过程的调控提供新的思路。