整合的转录组学和代谢组学分析揭示了用于提高谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中L-色氨酸产量的新遗传靶点

《Systematic and Applied Microbiology》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses uncover novel genetic targets for enhanced l-tryptophan production in Corynebacterium glutamicum

L-tryptophan过表达的枯草芽孢杆菌TR26与亲本株MB001的转录组和代谢组比较分析揭示了氮代谢调控基因glnK和糖代谢调控基因sugR的关键作用，通过CRISPRi抑制glnK和过表达sugR可使发酵产率分别提升10.3%和16.5%。

　　l-色氨酸是一种对人体和动物至关重要的氨基酸，因其在蛋白质合成、生理调节以及多种工业应用中的广泛价值而受到关注。近年来，微生物发酵技术在l-色氨酸生产中取得了显著进展，成为一种高效、经济且环保的生产方式。Corynebacterium glutamicum（简称C. glutamicum）作为一种具有高生物安全性和工业适应性的微生物底盘，被广泛用于氨基酸的工业生产。在本研究中，我们通过多轮理性的代谢工程策略，构建了一种能够高产l-色氨酸的C. glutamicum菌株TR26，并通过比较转录组学和代谢组学分析，揭示了其在l-色氨酸生产中的分子机制，同时识别出潜在的代谢瓶颈。

在对TR26与它的亲本菌株MB001进行比较分析时，我们发现其在多个方面发生了显著变化。首先，在代谢组学层面，TR26的细胞内代谢物浓度发生了明显变化，其中一些关键代谢物如色氨酸前体——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的浓度有所增加，表明这些前体的供应并非限制因素。然而，一些其他代谢物如丙酮酸和三羧酸循环（TCA）的中间产物浓度却有所下降，这提示TR26可能将更多的碳流从生物量生成转向了l-色氨酸的合成。此外，l-乳酸的浓度显著降低，这与TR26中乳酸脱氢酶基因ldh的删除有关。这些代谢物的变化表明，TR26在代谢路径的重新编程方面取得了显著成效。

在转录组学分析中，我们观察到TR26与MB001在不同生长阶段的基因表达模式发生了显著差异。在指数生长期，TR26中有455个基因被显著下调，524个基因被显著上调；而在静止生长期，有392个基因被下调，343个基因被上调。这些差异可能与菌株在不同生长阶段对代谢调控的需求不同有关。通过KEGG通路富集分析，我们发现这些差异基因主要涉及微生物代谢、氨基酸合成以及ABC转运蛋白等通路，表明TR26在氨基酸代谢方面进行了系统性的调整。其中，一些关键基因如aroC和aroD在色氨酸合成通路中被显著上调，这进一步支持了其在优化色氨酸合成路径方面的有效性。

为了进一步识别可能影响l-色氨酸生产的基因靶点，我们利用CRISPR干扰（CRISPRi）系统对TR26中一些差异表达的基因进行了靶向调控。结果显示，对glnK和sugR的调控显著提升了l-色氨酸的产量和得率。具体而言，在补料分批发酵过程中，glnK的抑制使l-色氨酸产量提高了10.3%，得率提升了7.2%；而sugR的过表达则使l-色氨酸产量提高了16.5%，得率提升了20.2%。这些结果表明，glnK和sugR在调控l-色氨酸合成中具有重要作用。

glnK是C. glutamicum氮代谢系统中的关键调控蛋白，其与全局转录因子AmtR相互作用，影响氮的吸收和同化过程。当glnK被抑制时，AmtR调控的基因表达水平显著下降，这可能意味着菌株对氮的吸收和同化能力降低。然而，由于发酵培养基中氮源充足，这种抑制并未导致细胞内氮的不足，反而可能促使细胞资源的重新分配，有利于色氨酸的合成。通过进一步的代谢分析，我们发现glnK抑制后，细胞内l-谷氨酸和l-谷氨酰胺的浓度显著下降，表明该调控可能减少了对这些氮丰富氨基酸的合成，从而将更多的资源投入到色氨酸的生产中。

sugR则是一种调控糖代谢的全局转录因子，其主要功能是抑制磷酸转移酶系统（PTS）相关基因的表达，包括ptsI、ptsH、ptsF、ptsG和ptsS等。PTS是C. glutamicum中糖摄入的主要途径，依赖PEP作为磷酸化供体，这与色氨酸合成路径存在竞争关系。相反，非PTS途径利用ATP进行磷酸化，通常在正常条件下不活跃。当sugR被过表达时，PTS相关基因的表达水平显著下降，而非PTS相关基因如iolT1和glk的表达则显著上升。这表明，sugR的过表达可能促使菌株从PTS途径转向非PTS途径进行糖的摄入，从而减少PEP在糖摄入过程中的消耗，提高其在色氨酸合成路径中的可用性。这种调控机制为优化色氨酸生产提供了新的思路。

本研究通过整合转录组学和代谢组学分析，揭示了C. glutamicum在l-色氨酸生产中的调控网络，为后续的工业菌株优化奠定了基础。glnK的抑制和sugR的过表达分别通过影响氮代谢和糖代谢，为提高l-色氨酸产量提供了有效的策略。此外，这些发现还表明，通过深入理解微生物的代谢调控机制，可以更有效地进行代谢工程设计，从而提高工业微生物的生产性能。未来的研究可以进一步探索这些基因在不同发酵条件下的具体作用，以及它们与其他代谢路径之间的相互作用，以实现更高效的l-色氨酸生产。