一种高效的CRISPR-Cas12a工具，用于迭代基因组编辑、简化最小化过程以及对Pseudomonas phage S1的载荷工程改造

《Systematic and Applied Microbiology》：An efficient CRISPR-Cas12a tool for iterative genome editing, streamlined minimization, and payload engineering of Pseudomonas phage S1

噬菌体基因组编辑：CRISPR-Cas12a系统在铜绿假单胞菌噬菌体S1中的应用与基因组减毒研究。

　　### 精准工程化噬菌体基因组的进展

在现代生物技术和治疗开发领域，能够对噬菌体基因组进行精确工程化的能力变得至关重要。噬菌体作为天然的细菌病毒，因其独特的结构和高效的感染机制，在合成生物学和抗菌治疗中展现出巨大的潜力。然而，天然噬菌体往往携带大量未明确功能的基因，这不仅增加了安全评估的复杂性，也限制了其在临床应用中的潜力。因此，开发一种高效、无痕的基因组编辑方法，对于推动噬菌体作为安全有效的治疗工具具有重要意义。

本研究中，我们引入了一种基于CRISPR-Cas12a的高效、无痕基因组编辑系统，专门用于一种具有致病性的铜绿假单胞菌噬菌体——vB_PaeM_SCUT-S1（以下简称S1）。该系统通过一个双质粒策略，实现了对S1基因组的高效编辑，包括基因删除、点突变、基因插入和替换。该系统不仅在基因编辑效率上表现优异，还能够有效减少基因组大小，为噬菌体的工程化设计和功能研究提供了新的工具。

### CRISPR-Cas12a在噬菌体基因组编辑中的应用

为了评估该系统的编辑效率，我们设计了一系列crRNA表达质粒，并通过点斑试验（spot test）和PCR验证来检测基因编辑的效果。结果显示，该系统能够实现接近100%的编辑效率，包括对S1基因组中特定基因的删除和替换。例如，使用crRNA靶向orf073基因，我们成功地实现了基因的删除，并且通过调整crRNA设计，克服了之前在基因替换过程中遇到的潜在毒性问题。

此外，我们还发现该系统在基因插入方面的效率同样出色。通过将外源基因如β-半乳糖苷酶（lacZ）或溶菌酶（lys009）插入到S1基因组中，我们成功构建了具有扩展功能的噬菌体变种。这些变种不仅保留了噬菌体的基本结构和感染能力，还能够在不干扰其复制和传播的情况下，携带较大的外源基因片段。

### 噬菌体基因功能的系统性研究

通过该系统的应用，我们对S1基因组中的38个假定功能基因进行了系统的删除和功能分析。这些基因在噬菌体生命周期中可能扮演不同的角色，包括DNA复制、重组修复、核苷酸代谢以及噬菌体结构和包装等。我们通过多次基因删除实验，最终成功构建了一个基因组减少13.9 kb的最小化噬菌体变种S1_200L。该变种不仅保持了对宿主细菌的感染能力，还支持插入较大的外源基因片段，这在噬菌体工程化中是一个重要的突破。

在对S1_200L的进一步研究中，我们发现其对宿主细菌的抑制能力与原始噬菌体相似，尽管在早期感染阶段的抑制效率有所下降，但在后期感染阶段的抑制效果显著增强。这一结果表明，即使在基因组大幅缩减的情况下，噬菌体仍能维持其生物学功能，为噬菌体作为治疗工具提供了新的可能性。

### 噬菌体基因功能的非冗余分析

在对S1基因组中假定功能基因的分析中，我们发现一些基因虽然在基因组中存在，但并不对噬菌体的生存和感染能力至关重要。例如，orf053（即holin基因）的缺失并未显著影响噬菌体的感染效率，这可能是因为存在功能冗余基因来补偿其缺失。这一发现为噬菌体基因组的优化提供了新的思路，即在不损害噬菌体功能的前提下，通过去除非必需基因来减少基因组大小，从而提高其在治疗中的应用潜力。

此外，我们还发现一些基因在单独删除时并不影响噬菌体的生存，但在同时删除时会导致噬菌体功能受损。这表明这些基因之间可能存在功能上的依赖关系，进一步强调了对噬菌体基因组进行系统性研究的重要性。

### 噬菌体基因组编辑的实验方法

为了构建和验证这些基因编辑后的噬菌体变种，我们采用了多种实验方法。首先，通过质粒构建和Gibson组装技术，我们设计并合成了多个crRNA表达质粒，这些质粒能够高效地引导CRISPR-Cas12a系统进行基因组编辑。其次，我们利用点斑试验和PCR分析来评估编辑效果，确保所得到的噬菌体变种具有预期的基因组结构和功能。

在噬菌体的扩增和表征过程中，我们采用了一种标准化的培养和裂解方法，以确保实验结果的可重复性和准确性。通过透射电子显微镜（TEM）观察，我们确认了基因组编辑后的噬菌体在形态上与原始噬菌体相似，说明该系统的应用并未影响噬菌体的基本结构。此外，我们还通过一步生长曲线和裂解动力学分析，评估了编辑后的噬菌体在感染过程中的表现，确保其在实际应用中的可行性。

### 噬菌体工程化的未来展望

本研究展示了一种高效、无痕的噬菌体基因组编辑方法，为噬菌体在合成生物学和抗菌治疗中的应用提供了新的工具。通过系统性地分析和编辑噬菌体基因组，我们不仅能够深入理解噬菌体的基因功能，还能够构建具有特定功能的噬菌体变种，以满足不同的治疗需求。例如，通过插入溶菌酶或β-半乳糖苷酶等外源基因，我们能够增强噬菌体对耐药细菌的杀伤能力，或使其成为基因表达的载体。

此外，该系统在基因组编辑的效率和灵活性方面具有显著优势。与传统的同源重组方法相比，CRISPR-Cas12a系统能够实现更高的编辑效率，并且不需要额外的筛选标记。这使得基因组编辑过程更加简便和高效，为大规模的噬菌体工程化提供了可能。

### 噬菌体基因组编辑的潜在应用

随着噬菌体工程化技术的发展，其在多个领域的应用前景日益广阔。首先，在抗菌治疗方面，噬菌体因其对特定细菌的高选择性和低毒性，被视为抗生素耐药性问题的潜在解决方案。通过精确编辑噬菌体基因组，我们可以去除不必要的基因，从而提高其安全性，并增强其对耐药细菌的感染能力。

其次，在合成生物学领域，噬菌体可以作为基因表达的载体，用于递送特定的基因或蛋白。通过将外源基因插入到噬菌体基因组中，我们可以构建具有特定功能的噬菌体变种，用于生物传感、生物制造或其他生物技术应用。

最后，在基础科学研究中，噬菌体基因组的编辑为研究基因功能提供了重要的工具。通过系统性地删除和替换特定基因，我们可以探索这些基因在噬菌体生命周期中的作用，从而为噬菌体的生物学研究提供新的视角。

### 结论

本研究展示了一种基于CRISPR-Cas12a的高效、无痕噬菌体基因组编辑系统，为噬菌体在抗菌治疗和合成生物学中的应用提供了重要的技术支持。通过系统性地分析和编辑噬菌体基因组，我们不仅能够深入理解噬菌体的基因功能，还能够构建具有特定功能的噬菌体变种，以满足不同的研究和应用需求。这一成果为未来噬菌体工程化的发展奠定了坚实的基础，也为解决抗生素耐药性问题提供了新的思路。