《Tetrahedron Letters》：Recent advances related to purification handles for oligonucleotide separation
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寡核苷酸固相合成中副产物分离技术综述，DMTr等疏水标签通过差异疏水性实现目标序列与短链副产物分离，涵盖聚合捕获法、疏水封端剂及新型疏水基团开发。
Yasufumi Fuchi|Yoshiyuki Hari
德岛文理大学药学部，日本德岛县山城町西滨770-8514
摘要
在寡核苷酸（ONs）的固相合成过程中，不仅会生成目标寡核苷酸，还会产生不需要的副产物，包括较短长度的寡核苷酸。然而，由于这些副产物具有相似的物理化学性质，因此通常难以通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）等色谱方法进行分离。为了便于将目标寡核苷酸与不需要的副产物分离，人们采用了4,4′-二甲氧基三苯甲基（DMTr）作为纯化修饰基团。迄今为止，除了DMTr基团外，还报道了几种含有亲脂基团的纯化修饰基团。本文总结了与寡核苷酸纯化相关的最新进展和方法。
引言
寡核苷酸（ON）药物（如反义寡核苷酸、siRNA等）被越来越多地用于治疗多种难治性疾病[[1], [2], [3], [4], [5]]。这些寡核苷酸需要经过碱基、糖或磷酸基团的修饰[[6], [7], [8]]，以增强与目标序列的结合能力并提高对核酸酶的稳定性。这类人工寡核苷酸通常通过固相合成（SPOS）方法制备，该方法利用磷酰胺化反应在DNA或RNA链的3′到5′方向上进行延伸，具体步骤包括重复偶联、封端、氧化和脱保护（去三苯甲基化）。修饰通常通过在偶联步骤中加入磷酰胺化衍生物或在氧化步骤中加入硫化试剂来实现。SPOS完成后，目标寡核苷酸通过氨水等碱处理从固相载体上释放出来，并通过反相（RP）HPLC进行纯化。从固相载体上释放出的粗溶液中包含多种副产物[[13], [14], [15]]，如较短长度的寡核苷酸和未完全脱保护的寡核苷酸。然而，在RP-HPLC纯化过程中，由于这些副产物与目标寡核苷酸的物理化学性质相似，因此难以将它们分离。为了解决这个问题，人们在纯化过程中使用了各种纯化修饰基团（或疏水标签）。最典型的方法是采用4,4′-二甲氧基三苯甲基（DMTr）作为纯化修饰基团的SPOS方法（图1）[18,19]。SPOS后的碱处理会产生带有5′-DMTr标签的全长寡核苷酸和较短长度的失败产物。由于疏水性差异，这两种物质可以在RP柱上轻松分离。随后，用酸性溶液对标记的寡核苷酸进行去三苯甲基化处理，再通过进一步的HPLC纯化得到纯化的目标寡核苷酸。此外，还有用于将带有DMTr标签的目标寡核苷酸与失败产物分离的固相萃取（SPE）柱[20,21]。在DMTr-on合成中，可以通过测量504 nm处的吸光度来定量测定DMTr阳离子的含量，从而估算目标寡核苷酸的合成产率[22]。迄今为止，除了DMTr基团外，还报道了几种其他类型的纯化修饰基团。早期开发了多种用于5′-保护的三苯甲基衍生物，以进一步提高DMTr基团的亲脂性，例如长链烷氧基取代的三苯甲基[23]、4-甲氧基-4′-辛氧基三苯甲基[24]、全氟烷氧基取代的DMTr衍生物[FDMT]以及含有荧光基团（如芘[26,27]或四苯[a,c,g,i]fluorene[28]）的DMTr衍生物。尽管如此，DMTr基团仍然被广泛使用。同时，新的纯化修饰基团（或疏水标签）也在不断开发中。例如，最近出现了具有可聚合、光可去除和热不稳定等特性的标签。此外，还有人在SPOS过程中使用了其他纯化修饰基团，如用于失败产物的疏水封端试剂或疏水通用连接器。本文总结了与寡核苷酸分离相关的最新纯化修饰基团及其方法。
小节摘录
聚合捕获法
Fang及其同事报道了一种含有甲基丙烯酰胺单元的DMTr衍生物，并将这种SPOS方法称为“聚合捕获（CBP，图2）”[[29], [30], [31], [32], [33]]，该方法通过聚合反应实现目标寡核苷酸（全长）与失败产物的分离。下面介绍了使用CBP的纯化方法：首先制备含有可聚合甲基丙烯酰胺基团的磷酰胺化衍生物，并通过SPOS将其引入寡核苷酸的5′末端。
疏水封端试剂
在SPOS过程中产生的失败产物中，缺少部分所需残基的短寡核苷酸难以通过RP-HPLC纯化去除，因为它们的性质与目标寡核苷酸相似。为了解决这个问题，Obika及其同事在2024年开发了一种疏水封端试剂[34]（图3），用于标记这些短寡核苷酸。通常在SPOS之后，通过碱性处理去除失败产物中的乙酰基封端结构以实现切割和脱保护。
疏水通用连接器衍生物
在寡核苷酸药物的大规模生产和高通量合成中[37, 38]，常使用连接到固相载体上的通用连接器。SPOS完成后，与3′-末端磷酸基团结合的通用连接器通常会在碱性条件下被消除。但如果3′-去磷酸化反应不完全，仍会残留具有目标寡核苷酸性质的产物。
5′-烷氨基修饰寡核苷酸的合成
在合成寡核苷酸的5′末端引入活性胺基团对于制备各种寡核苷酸衍生物至关重要[44,45]。含有单甲氧基三苯甲基（MMTr）保护的烷基胺的磷酰胺化衍生物成本较低，常被用作5′修饰的构建块。MMTr保护同样可作为酸不稳定的纯化修饰基团，类似于DMTr保护。然而，由于MMTr基团可能重新附着，因此无法使用RP-SPE柱进行纯化。
用于酶法合成5′- capped mRNA的疏水封端类似物
除了用于5′-磷酸化RNA的CPR4外，Abe等人还报道了名为“PureCaps”的疏水封端类似物，用于 capped mRNA的纯化（图9A）[[61], [62], [63]]。其中，N7-甲基鸟苷（m7G）通过5′-5′三磷酸桥连接到mRNA的5′末端，在mRNA疫苗等mRNA治疗中起着重要作用[64]。合成 capped mRNA的方法包括化学或半化学方法[65,66]以及酶促体外转录（IVT）[67]。
结论
本文总结了寡核苷酸纯化修饰基团的最新进展和方法。虽然最初使用DMTr基团进行纯化，但迄今为止已经开发出了多种策略。基于DMTr结构的纯化修饰基团被应用于聚合物的形成和5′-修饰寡核苷酸的合成。作为DMTr基团的替代疏水基团，2-硝基苯基、2-吡啶基、胆固醇和菲类衍生物也被采用。
作者贡献声明
Yasufumi Fuchi：撰写原始稿件。Yoshiyuki Hari：撰写、审稿和编辑，概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
