人博卡病毒NP1蛋白通过抑制STAT1核转运拮抗宿主I型干扰素应答的机制研究

《Virulence》：Human bocavirus NP1 antagonizes host type I interferon response through repressing the nuclear transport of STAT1

本研究发现人博卡病毒1型（HBoV1）的非结构蛋白NP1通过结合STAT1的DNA结合域（DBD）和核转运蛋白KPNA1的导入素β结合域（IBB），破坏STAT1/KPNA1/KPNB1复合物形成，从而抑制STAT1核转位和I型干扰素（IFN-I）信号通路。该研究揭示了HBoV1免疫逃逸的新机制，为理解病毒混合感染致病性提供了重要理论依据。

　　

人博卡病毒NP1蛋白对I型干扰素信号的拮抗机制

引言

下呼吸道感染是全球五岁以下儿童中最普遍的疾病和主要死亡原因，给社会和家庭带来沉重负担。人博卡病毒（HBoV）是近20年来新发现的呼吸道病毒家族成员，其与儿童呼吸道疾病的关联日益受到关注。2005年，Allander团队首次在人类鼻咽标本中鉴定出人博卡病毒1型（HBoV1），这是一种可引起儿童急性呼吸道感染的人类细小病毒。HBoV1感染可导致哮喘、细支气管炎和肺炎，典型症状包括鼻漏、发热和咳嗽。随后几年，研究人员在人类粪便标本中又鉴定出三种HBoV亚型——HBoV2、HBoV3和HBoV4。目前全球HBoV呼吸道感染患病率约为6.3%，临床病例常表现为与其他病毒和细菌病原体的高频率混合感染。

HBoV1是一种无包膜的20面体对称病毒，基因组为约5500bp的单链DNA，两端具有"发夹"结构。其基因组包含三个开放阅读框（ORF），编码六种非结构蛋白（NS1、NS1-70、NS2、NS3、NS4和NP1）和三种结构蛋白（VP1、VP2和VP3）。此外，HBoV1基因组还能转录一个140bp的长链非编码RNA（lncRNA），称为BocaSR。NP1在病毒衣壳蛋白表达和mRNA加工中起关键作用，并直接参与病毒DNA在复制起点（OriR）的复制。

当病毒入侵时，宿主通过模式识别受体（PRR）识别病原体相关分子模式（PAMP），启动先天免疫应答。这一过程激活多种信号通路，导致干扰素（IFN）和各种细胞因子的产生。I型干扰素（IFN-I）通过Toll样受体（TLR）通路、视黄酸诱导基因I样受体（RLR）通路和环GMP-AMP合成酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）通路产生，在抗病毒过程中起关键作用。IFNα/β分泌到细胞外，与其受体亚基IFNAR1和IFNAR2结合，激活Janus激酶（JAK）-STAT信号通路。STAT1被招募到IFNAR2，其酪氨酸701位点被JAK1磷酸化。磷酸化的STAT1和STAT2招募IRF9形成干扰素刺激基因因子3（ISGF3）复合物，该复合物迁移到细胞核并与启动子区域的干扰素刺激反应元件（ISRE）结合，诱导多种具有抗病毒作用的干扰素刺激基因（ISG）的转录和翻译。

材料与方法

本研究使用HEK293T、Vero、Hep2和A549细胞系，这些细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。实验使用的病毒包括表达绿色荧光蛋白（GFP）的水泡性口炎病毒（VSV-GFP）、呼吸道合胞病毒（RSV）L19株和H1N1/PR/8/34流感病毒。动物实验使用BALB/c小鼠，所有动物均在特定病原体（SPF）环境中饲养。

实验方法包括双荧光素酶报告基因检测（DLR）、实时定量PCR（RT-qPCR）、免疫共沉淀（Co-IP）、质谱分析（MS）、免疫荧光显微镜、核质分离实验、Western blotting、GST pull-down、病毒滴度测定、空斑实验和慢病毒制备等。统计学分析使用Prism 8软件，两组间差异显著性采用非配对双尾Student t检验进行评估。

结果

HBoV1 VP1、VP2和NP1蛋白拮抗IFNβ产生

为了研究HBoV1蛋白与IFN-I的关系，研究人员基于病毒基因组结构，通过同源重组将六个HBoV1基因克隆到哺乳动物过表达载体pEGFP-Flag-N1中。Western blotting证实所有六种病毒质粒均成功表达。免疫荧光结果显示，VP1、VP2和NS1-70主要位于细胞质，而UP1和NS1主要位于细胞核，NP1在细胞质和细胞核中均有检测到。

为了研究HBoV1蛋白对IFNβ产生的影响，研究人员使用cGAS/STING通路作为模型模拟DNA病毒感染。将六种HBoV1蛋白质粒与IFNβ-Luc和pRL-TK共转染HEK293T细胞，通过双荧光素酶报告基因检测发现VP1、VP2和NP1蛋白显著抑制IFNβ启动子活性。RT-qPCR分析显示这三种蛋白显著降低cGAS/STING刺激细胞中IFNβ mRNA水平。ELISA实验进一步证实VP1、VP2和NP1均显著降低IFN-β的产生。

HBoV1 VP1、VP2和NP1蛋白抑制IFN信号和ISG产生

在IFN-I产生后，其分泌到细胞外与受体结合激活JAK-STAT信号通路。ISGF3复合物转位到细胞核，与ISRE启动子结合，促进各种ISG的转录和翻译。研究人员将六种HBoV1质粒与ISRE-Luc和pRL-TK共转染HEK293T细胞，cGAS/STING刺激后，VP1、VP2和NP1显著抑制ISRE启动子活性。RT-qPCR分析显示这三种蛋白显著降低ISG15、IFIT1和CIG5的mRNA水平。直接使用IFNβ（400 U/mL）刺激HEK293T细胞也得到类似结果。Western blotting进一步证实NP1最能显著抑制cGAS/STING或IFN-β刺激后ISG15、IFIT1和CIG5的蛋白表达。

NP1抑制STAT1的核输入

虽然HBoV1蛋白已被报道通过干扰IFN-I信号通路中的分子（如RIG-I和IRF3）来抑制IFN-I产生，但它们对IFN-I下游信号通路的影响尚不清楚。本研究发现在IFNβ刺激下，HBoV1蛋白对ISRE启动子活性和ISG mRNA水平表现出更强的抑制作用。

研究人员在HEK293T细胞中过表达六种HBoV1蛋白质粒，并用IFNβ（400 U/mL）刺激细胞12小时。结果显示这些病毒蛋白不改变IFN-I信号通路下游分子（JAK1、Tyk2、STAT1、STAT2、IRF9）的表达水平或其磷酸化状态（p-JAK1、p-Tyk2、p-STAT1、p-STAT2）。

针对VP1、VP2和NP1的免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS）分析显示，NP1可能与STAT1存在相互作用。不同浓度NP1质粒（0 ng、500 ng、1500 ng）转染实验表明，NP1不影响STAT1的表达或磷酸化，因此研究人员推测NP1可能影响STAT1的核输入。

免疫荧光实验显示，NP1过表达显著抑制STAT1的核转位。核质分离实验进一步证实，NP1存在时，细胞质中p-STAT1水平增加而细胞核中减少，表明NP1抑制STAT1核转位。

NP1与STAT1和KPNA1的相互作用

细胞质到细胞核的转运是真核细胞中的关键过程。分子进入细胞核需要核转运蛋白家族的协助，特别是导入素。导入素-α（KPNA）是最早被发现的，作为连接蛋白，连接含有经典核定位信号（cNLS）的核输入分子与导入素-β（KPNB）。

研究人员通过免疫共沉淀证实NP1与STAT1和KPNA1存在相互作用。体外GST pull-down实验进一步证明NP1直接与STAT1和KPNA1结合。根据STAT1和KPNA1的域结构，通过同源重组构建截短蛋白，发现NP1与STAT1的318-488 AA区域（DBD）和KPNA1的1-114 AA区域（包含重要的IBB域）相互作用。分子对接模拟显示NP1（K155、R186、N191、S194、Q195、D203）与STAT1（R321、P329、T342、E394、T396、R405）之间存在相互作用，NP1（R163、W167、R170、D174、E176、R177、C178、Y180、W181、A210、E211）与KPNA1（R48、A51、E54、E55、E56、E58、E59、M62、S63、K112、P114）之间存在相互作用。

NP1抑制STAT1-KPNA1和KPNA1-KPNB1的相互作用

KPNA1是介导p-STAT1核转位的主要核转运蛋白。磷酸化后，STAT1的DBD暴露，使其能够与KPNA1结合。同时，KPNB1与KPNA1的IBB域相互作用，形成p-STAT1-KPNA1-KPNB1三聚体复合物，通过核孔复合物转位到细胞核内。

免疫共沉淀实验显示，NP1过表达显著抑制STAT1与KPNA1的相互作用。基于NP1与STAT1 DBD的结合，研究人员提出NP1通过竞争性结合STAT1的DBD，拮抗STAT1-KPNA1复合物的形成。同样，NP1也抑制KPNA1与KPNB1的相互作用，通过竞争性结合KPNA1的N端IBB域，阻止STAT1的核输入。

这些发现表明，NP1通过与STAT1的DBD和KPNA1的N端IBB域相互作用，破坏STAT1/KPNA1/KPNB1复合物的形成，从而损害STAT1核转运，抑制ISRE启动子活性和ISG表达，促进免疫逃逸。

NP1促进其他病毒的复制

NP1在病毒复制过程中的重要作用已得到充分证实。本研究进一步证明NP1抑制IFNβ和ISRE的启动子活性，以及IFNβ、ISG15、IFIT1和CIG5的mRNA水平。

为评估NP1对病毒复制的影响，研究人员用VSV（MOI = 0.5）感染HEK293T细胞8小时。通过荧光显微镜、Western blotting、RT-qPCR和TCID₅₀测定评估病毒含量，结果显示NP1有效抑制IFNβ的抗病毒作用，从而促进VSV-GFP复制。

在Hep2细胞中过表达NP1后感染RSV，48小时后通过病毒荧光成像、RT-qPCR分析和Western blotting评估RSV含量，发现NP1促进RSV复制。类似地，在A549细胞中过表达NP1后感染H1N1，RT-qPCR分析和Western blotting显示H1N1复制增强。同时，NP1介导的IFNβ产生抑制表现为IFNβ mRNA水平降低，表明HBoV1通过部分抑制IFNβ产生促进H1N1复制。

NP1在体内促进H1N1复制

由于HBoV1仅感染高度分化或极化的人原代气道上皮细胞，需要特殊的气液界面培养技术，缺乏合适的细胞系和动物模型给HBoV1研究带来巨大挑战。

为研究HBoV1 NP1的作用，研究人员使用plv-NP1-Flag慢病毒感染小鼠（2×10⁷ PFU尾静脉注射）。注射7天后，小鼠鼻内接种H1N1（1×10⁶ PFU）。接种4天后处死小鼠，收集肺组织进行分析。RT-qPCR、Western blotting和空斑实验显示，预感染NP1表达慢病毒的小鼠在H1N1共感染后表现出更高的H1N1 mRNA和蛋白水平以及病毒滴度。肺组织HE染色显示，NP1慢病毒和H1N1共感染小鼠肺部病变更严重，表现为组织结构紊乱、间隔增厚和炎性细胞显著浸润。肺组织样本RT-qPCR分析显示，共感染小鼠Ifnβ mRNA水平显著低于单独感染H1N1的小鼠。Isg15、Ifit1和Cig5水平也较低，尽管这些差异未达到统计学显著性。这些结果表明NP1通过抑制IFNβ产生和某些ISG的mRNA水平促进H1N1复制。

讨论

呼吸道感染是儿童最常见的疾病，也是全球5岁以下儿童的主要死亡原因。HBoV作为近20年来新发现的呼吸道病毒，其与儿童呼吸道疾病的关联及其疾病负担日益受到关注。

本研究发现HBoV1 NP1蛋白抑制IFNβ产生，这一发现与Zhang等人的研究一致。更重要的是，NP1通过结合STAT1的DBD和KPNA1的N端区域，干扰STAT1/KPNA1/KPNB1复合物的形成，竞争性抑制STAT1的核输入，抑制多种ISG的表达。

据报道，HBoV1 NP1的N端区域（残基7-50）包含一个非经典核定位信号（ncNLS），主要定位于细胞核。然而有趣的是，我们在免疫荧光和核分离实验中观察到NP1在细胞质和细胞核中均有存在。我们推测，HBoV1可能通过受体介导的内吞作用进入细胞，经早期到晚内体运输后到达细胞核。NP1的细胞质定位可能反映了病毒进入和运输的早期阶段，而其细胞核存在则反映了病毒进入细胞核后的生命周期。

临床病例显示，HBoV感染常与其他病毒和细菌呼吸道或胃肠道病原体混合感染。在呼吸道样本中，高达83%的感染为混合感染，其中RSV是最常见的共感染病原体。近年来，越来越多的报告强调HBoV可引起严重感染，其中一些危及生命。然而，目前关于HBoV混合感染是否加重疾病严重性的研究存在争议。

我们在体内外实验中均发现HBoV1 NP1增强H1N1的复制。然而，适合活HBoV1病毒培养和实验的细胞系或动物模型仍然严重有限。据报道，由HBoV1双基因组形成的感染性克隆可在HEK293T细胞中复制，转染后产生高滴度的后代病毒颗粒，克服了HBoV1培养和获取的挑战。基于此，我们通过同源重组生成了HBoV1的全长克隆T boca，部分模拟所有HBoV1蛋白的表达，并证实其也促进H1N1和RSV的复制。这些发现为理解临床混合感染提供了理论基础。

总之，我们的研究表明HBoV1 NP1通过结合STAT1的DBD和KPNA1的N端区域，抑制STAT1/KPNA1/KPNB1复合物的形成，竞争性抑制STAT1的核输入。这些发现为控制儿童HBoV1感染策略提供了理论支持，并为未来疫苗和治疗干预措施的开发奠定了基础。