结核分枝杆菌ESAT-6通过GSDMD-NT依赖性线粒体功能障碍激活cGAS-STING通路的新机制

《Virulence》：Mycobacterial ESAT-6 triggers cGAS-STING pathway via the GSDMD-NT dependent mitochondria dysfunction

本研究揭示了结核分枝杆菌毒力因子ESAT-6通过诱导Gasdermin D (GSDMD)裂解，其N端片段(GSDMD-NT)靶向线粒体并破坏其完整性，导致线粒体DNA (mtDNA)和活性氧(mtROS)释放，进而激活cGAS-STING依赖的I型干扰素(IFN-β)反应。该发现阐明了ESAT-6在宿主免疫应答中的新作用机制，为理解结核病的免疫病理及潜在治疗靶点提供了重要见解。

　　

引言

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种重大全球健康挑战性疾病。该细菌能够在宿主体内持续存在并逃避免疫系统，这是结核病呈慢性化的关键因素。在感染宿主的过程中，结核分枝杆菌利用多种毒力因子，其中早期分泌抗原靶点6kDa (ESAT-6)是促进免疫逃避的主要毒力因子之一。ESAT-6通过ESAT-6分泌系统-1 (ESX-1)分泌，在调节感染期间的先天和适应性免疫反应中扮演核心角色。既往研究表明，ESAT-6可通过激活巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞触发先天免疫反应，刺激肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)和白细胞介素-6 (IL-6)等关键促炎细胞因子的释放。此外，ESAT-6是激活NLRP3炎症小体的主要病原体相关分子模式 (PAMP)，其激活对于caspase-1介导的IL-1β、IL-18处理以及GSDMD的切割是必需的。

I型干扰素 (Type I IFNs) 最初被认为是有效的抗病毒因子，但近期研究表明它们在多种细菌感染引起的病理严重程度中也发挥作用。在结核分枝杆菌感染期间，I型干扰素与对病原体介导的细胞死亡的易感性增加密切相关，有利于分枝杆菌复制、组织损伤和细菌扩散。已有报道证实，cGAS (环状GMP-AMP合酶) 通过STING (干扰素基因刺激物)/TBK1 (TANK结合激酶1)/IRF3 (干扰素调节因子3) 通路在结核分枝杆菌感染期间诱导I型干扰素至关重要。本研究阐明了一种新机制，即ESAT-6通过GSDMD依赖性线粒体损伤和mtDNA释放，经由cGAS-STING通路诱导I型干扰素反应。

方法

本研究使用了多种抗体和试剂，包括针对TBK1、IRF3、ISG15、mCherry标签、GSDMD的抗体以及磷酸化TBK1和IRF3的抗体。细胞系包括人单核细胞THP-1、小鼠永生化骨髓来源巨噬细胞 (iBMDMs) 和HEK293T细胞。小鼠骨髓来源巨噬细胞 (BMDMs) 从C57BL/6小鼠 (野生型或Gsdmd基因敲除鼠) 的股骨中分离获得。研究通过慢病毒shRNA转导构建了cGAS敲低的THP-1细胞系，并通过CRISPR-Cas9技术构建了cGAS和GSDMD基因敲除的THP-1细胞系。重组ESAT-6蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达并通过镍柱亲和层析纯化。采用细胞质DNA免疫共沉淀和亚细胞分级分离技术检测cGAS与DNA的结合。通过用溴化乙锭 (EB) 长期处理细胞构建线粒体DNA缺失的ρ?细胞。采用蛋白质免疫印迹、定量实时PCR (qRT-PCR)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、活细胞共聚焦成像、免疫荧光和流式细胞术等方法进行检测和分析。

结果

ESAT-6激活巨噬细胞中的I型干扰素反应

为探究ESAT-6本身是否能诱导I型干扰素产生，研究用不同浓度的重组ESAT-6处理PMA分化的THP-1人单核细胞。结果显示，ESAT-6处理以剂量依赖的方式在转录水平和蛋白水平上触发IFN-β的产生。此外，IFN-β的转录水平在ESAT-6处理后2小时达到峰值，而其蛋白水平在8小时内呈时间依赖性增加。在小鼠BMDMs中也观察到类似结果。同时，ESAT-6也以剂量和时间依赖的方式诱导干扰素刺激基因ISG-15的产生。ESAT-6处理后的TBK1和IRF3磷酸化水平上调，表明ESAT-6激活了TBK1-IRF3通路。在THP-1细胞中诱导表达ESAT-6进一步证实了其激活I型干扰素通路的能力。这些数据共同证明ESAT-6在巨噬细胞中触发了I型干扰素反应。

ESAT-6诱导的I型干扰素反应依赖于cGAS/STING

既往研究表明结核分枝杆菌感染引发的I型干扰素反应依赖于cGAS。因此，研究旨在确定cGAS是否在ESAT-6诱导的IFN-β产生中起关键作用。通过慢病毒shRNA构建的cGAS敲低THP-1细胞系显示，与对照组相比，cGAS敲低细胞中IFN-β的表达显著降低，上清液中IFN-β的释放也减少。同时，cGAS敲低导致TBK1和IRF3磷酸化减少以及ISG15产生下降。在CRISPR/Cas9介导的cGAS缺陷THP-1细胞系中观察到类似结果，cGAS缺失导致对ESAT-6的I型干扰素反应显著减弱。研究进一步使用cGAS特异性抑制剂 (RU.521) 和STING特异性抑制剂 (H-151) 进行药理阻断，这些抑制剂有效抑制了ESAT-6引起的IFN-β表达。这些数据表明ESAT-6触发了一个cGAS-STING依赖性的I型干扰素反应。

ESAT-6引发线粒体损伤和mtDNA释放至细胞质

cGAS可响应来自细胞核或线粒体的双链DNA (dsDNA)。为确定ESAT-6刺激期间激活cGAS的dsDNA来源，研究用ESAT-6处理PMA分化的THP-1细胞，并通过qRT-PCR定量细胞质中线粒体DNA和核DNA水平。针对线粒体MT-ND1和核LINE-1 ORF1 (L1ORF1) 的引物显示细胞质mtDNA增加了两倍，而核DNA水平保持不变。在过表达mCherry标记的ESAT-6的HEK293T细胞中免疫共沉淀Flag标记的cGAS，并检测线粒体和核DNA，结果显示cGAS与mtDNA结合，而未检测到与最丰富的核DNA结合。通过低剂量EB培养细胞可实现mtDNA耗竭。在mtDNA耗竭的iBMDMs和THP-1细胞中，ESAT-6刺激未能诱导IFN-β产生。研究进一步探讨ESAT-6是否诱导线粒体膜电位 (ΔΨm) 去极化。用于标记线粒体的Mito-Tracker Deep Red的荧光强度在ESAT-6处理后显著降低，TMRM的强度也降低，证实ESAT-6诱导了线粒体功能障碍。这些数据共同表明ESAT-6诱导线粒体不稳定，促进mtDNA泄漏到细胞质中。

线粒体ROS参与ESAT-6介导的IFN-β产生

线粒体不稳定的一个标志是线粒体活性氧 (mtROS) 的上调。研究评估了ESAT-6刺激期间mtROS水平的变化。用ESAT-6处理THP-1和BMDM细胞4小时后，通过MitoSOX染色和流式细胞术检测mtROS水平，发现两者细胞中的mtROS水平均显著增加。使用mtROS清除剂Mito-TEMPO处理可降低ESAT-6引起的IFN-β反应。同时，抑制mtROS也导致TBK1和IRF3磷酸化减少以及ISG15产生下降。相比之下，用NAC抑制细胞质ROS并不影响对ESAT-6的I型干扰素反应。因此，线粒体ROS有助于ESAT-6介导的IFN-β产生。

GSDMD参与ESAT-6介导的线粒体损伤

研究接下来探讨ESAT-6诱导线粒体损伤的机制。既往研究表明结核分枝杆菌可诱导GSDMD依赖性焦亡。确实，ESAT-6在PMA分化的THP-1细胞中触发了GSDMD的切割，并在THP-1细胞和iBMDMs中导致乳酸脱氢酶 (LDH) 释放呈轻度但时间依赖性的增加。此外，观察到ESAT-6可与GSDMD相互作用。因此，研究假设GSDMD在ESAT-6介导的线粒体损伤中发挥作用。结果显示，GSDMD缺陷的THP-1细胞在ESAT-6处理后几乎完全丧失产生IFN-β的能力。GSDMD敲除也消除了TBK1和IRF3的磷酸化以及ISG15的产生。在GSDMD缺陷的BMDMs中诱导ESAT-6也观察到类似结果。一致的是，在GSDMD缺陷的THP-1细胞中，ESAT-6未能引起线粒体膜电位的变化或线粒体不稳定。此外，与野生型对照相比，GSDMD缺陷阻止了ESAT-6诱导的mtROS产生。

为阐明GSDMD切割与线粒体功能障碍的时间顺序关系，进行了ESAT-6刺激后的时间过程实验。GSDMD的切割和NT-GSDMD的生成在1分钟时即可检测到并随时间增加，而TBK1磷酸化在5分钟时变得明显，IRF3磷酸化在30分钟时达到峰值，表明GSDMD切割先于cGAS-STING通路的激活。研究进一步探究ESAT-6切割产生的GSDMD-NT是否易位至线粒体并引起线粒体损伤。通过共聚焦显微镜分析GSDMD-NT的定位，发现GSDMD-NT特异性定位于线粒体并在线粒体表面形成斑点。为了进一步证实，研究在GSDMD-KO THP-1细胞中构建了GSDMD-D275A (无法被切割产生GSDMD-NT) 的多西环素诱导表达细胞系。结果显示，表达GSDMD-D275A的细胞表现出IFN-β转录和分泌减少。这些结果共同表明，ESAT-6介导的GSDMD-NT诱导线粒体损伤，导致mtDNA和mtROS释放，继而触发I型干扰素反应。

讨论

本研究提供了证据表明结核分枝杆菌毒力因子ESAT-6通过涉及线粒体损伤、炎症小体激活和GSDMD-NT介导的线粒体不稳定的机制激活巨噬细胞中的I型干扰素反应。本研究的一个新发现是ESAT-6触发线粒体损伤，这是激活cGAS-STING通路的关键信号。线粒体功能障碍可导致mtDNA和mtROS的释放，二者都是cGAS-STING轴的强效激活剂。研究表明ESAT-6处理导致细胞质中mtDNA水平增加，而非核DNA，表明mtDNA是此背景下激活cGAS的主要信号。此外，ESAT-6诱导线粒体不稳定，表现为线粒体膜电位降低和mtROS释放。

研究发现的另一个有趣方面是GSDMD参与ESAT-6触发的线粒体损伤。GSDMD是焦亡的关键介质，最近被发现与炎症小体激活和线粒体功能障碍相关。研究表明ESAT-6与GSDMD相互作用并导致其切割，形成GSDMD-NT。重要的是，GSDMD-NT易位至线粒体，在那里共定位并诱导线粒体损伤，表现为线粒体膜电位丧失以及mtROS和mtDNA释放。这表明GSDMD-NT不仅在炎症小体介导的细胞死亡中发挥作用，而且在ESAT-6诱导的免疫反应期间作为线粒体损伤的关键介质。GSDMD在线粒体不稳定以及随后mtDNA和mtROS释放中的作用强调了其在结核分枝杆菌发病机制中的重要性。

值得注意的是，在THP-1细胞中，GSDMD KO完全消除了ESAT-6刺激下的IFN-β产生，但在BMDMs中仅部分降低了IFN-β水平。这种差异表明IFN-β的诱导依赖于不同细胞类型的不同信号通路。THP-1细胞主要利用cGAS-STING轴检测细胞质核酸并诱导IFN-β，而BMDMs还可能涉及Toll样受体 (TLR) 介导的通路，这种多功能并行通路的参与可能解释了BMDMs中GSDMD敲除后IFN-β的部分减少，提示存在功能冗余或补偿。

总之，本研究强调了一种结核分枝杆菌毒力因子ESAT-6激活I型干扰素反应的新机制。该过程涉及cGAS-STING通路的激活、线粒体损伤以及随后mtDNA和mtROS的释放。此外，研究确定GSDMD-NT是响应ESAT-6的线粒体不稳定和免疫激活的关键介质。这些发现不仅增强了我们对结核分枝杆菌免疫反应的理解，也为在结核感染背景下调节I型干扰素反应提出了潜在的治疗靶点。