当代禽流感A H9N2病毒在人呼吸道类器官中的复制增强：对人类适应性与传播风险的深入评估

《Emerging Microbes & Infections》：Enhanced replication of a contemporary avian influenza A H9N2 virus in human respiratory organoids

本研究深入探讨了当代禽流感A H9N2病毒在人呼吸道类器官中的复制增强现象，通过对比2024年与1999年人源分离株，揭示了病毒通过关键氨基酸替换（如HA-D183N/D190T/Q192R/Q226L、NA-del62-64、PB2-A588V/K702R/D253N等）增强对人类上、下呼吸道的适应能力，显著提高了病毒载量（达8 log10 PFU/mL）与细胞嗜性（2,6-唾液酸受体结合偏好），强调基于人源类器官的表型监测与宿主内基因进化分析对评估禽流感人畜共患风险的重要性。

　　

引言

禽流感A H9N2病毒自20世纪90年代末起引起散发性人类感染，已成为仅次于H5N1的第二常见感染人类的禽流感病毒亚型。尽管在禽类中表现为低致病性，H9N2在人类中可导致严重疾病，且隐性感染普遍。近年来人类感染病例数量显著上升，截至2025年6月6日，全球共报告168例人感染病例。H9N2的内部基因贡献了多数导致人类严重疾病的禽流感病毒（如H3N8、H5N1、H7N9等），其在中国家禽中的流行率已超过H5N6和H7N9。此外，大多数H9N2毒株携带HA Q226L、I155T和H183N等替代突变，优先结合人源2,6-唾液酸（SA）受体，NA茎部62-64位缺失增强病毒进入人体细胞的能力。

方法

本研究采用2024年香港人源分离株A/HK/2346/2024与1999年历史株A/HK/1073/1999，在MDCK细胞、人鼻类和肺类器官中比较病毒复制能力。通过免疫荧光染色分析细胞嗜性（纤毛细胞、非纤毛细胞、2,3-/2,6-SA阳性细胞），采用微基因组报告 assay 评估聚合酶活性，并在BALB/c小鼠模型中评估病毒载量与致病性。全基因组测序（Oxford Nanopore MinION）与系统发育分析（GISAID数据库）用于鉴定氨基酸替换与进化关系，分子对接模拟（Rosetta）研究NP蛋白与人MX1的相互作用。

结果

患者与家庭接触者

2024年患者为22月龄女童，无直接禽类接触史，表现为发热与咳嗽。发病第1天鼻咽拭子（NPS）检出H9N2（A/HK/2346/2024），第7天住院后口服奥司他韦，病情轻微。发病第7-9天鼻咽抽吸物（NPA）持续病毒RNA阳性，但病毒培养仅第1天样本成功。3名家庭接触者中，1人出现咽痛但所有呼吸道样本PCR阴性。血清中和抗体显示，对A/HK/2346/2024的抗体滴度（convalescent serum: 10）高于A/HK/1073/1999（<10），提示近期暴露可能。

病毒在MDCK细胞与人类器官中的复制

在MDCK细胞中，A/HK/2346/2024复制更快（24 hpi出现CPE），72 hpi病毒滴度达8 log₁₀ PFU/mL，显著高于A/HK/1073/1999的5 log₁₀ PFU/mL。在人鼻类器官（3供体）与肺类器官（1供体）中，A/HK/2346/2024复制至6 log₁₀ PFU/mL，而A/HK/1073/1999未能检测到活病毒。免疫荧光显示A/HK/2346/2024感染细胞比例更高。

细胞嗜性分析

在鼻与肺类器官中，两病毒均优先感染纤毛细胞，但A/HK/2346/2024对2,6-SA阳性细胞的感染比率更高（鼻类器官: 1.53 vs. 1.40；肺类器官: 2.93 vs. 0.74），表明其增强的复制能力源于对纤毛/非纤毛细胞的更好感染与2,6-SA结合偏好。

聚合酶活性与小鼠感染

微基因组报告 assay 显示A/HK/2346/2024聚合酶活性弱于A/HK/1073/1999，表明复制增强非聚合酶活性驱动。小鼠模型中，两毒株均未导致死亡或体重显著下降，但A/HK/2346/2024在鼻甲病毒载量更高（4 dpi），而A/HK/1073/1999在肺中复制更强，提示感染模式差异。

系统发育与氨基酸替换分析

系统发育分析表明，2024毒株HA、NA、PA、PB2基因与近年人源H9N2（如广东2021-2023株）或H3N8（如广东2023株）密切关联，内部基因（PB1、NP、NS、M）则与禽源H9N2/H3N8相近，暗示基因重配可能。2024毒株携带多个哺乳动物适应性替换：HA-183N/190T/192R/226L（增强2,6-SA结合与空气传播）、NA-Δ62-64（增强细胞进入）、PB2-588V/702R/253N（增强哺乳细胞聚合酶活性）、PB1-368V、PA-356R/409N、M1-95K（逃逸TRIM21限制）。发病第7天样本中，de novo出现PB2-D253N（覆盖率66%）与NP-R19C（52%）替换，其中PB2-D253N罕见（<0.1%禽/人株），可增强哺乳细胞聚合酶活性；NP-R19C分子对接显示不参与MX1结合。

全球适应性突变趋势

对GISAID中96例人源与14762例禽源H9N2的分析显示，人类适应性突变（如HA-T192R、NA-Δ62-64、PB1-I368V、PB2-A588V）在人类毒株中占比更高，且随时间推移普遍增加，凸显H9N2持续人化适应。

讨论

本研究证明当代H9N2毒株在人类呼吸道类器官中复制效能显著增强，可能提升人际传播与致病风险。上呼吸道病毒载量与传播性相关，而鼻类器官模型生理近似人上呼吸道，互补哺乳动物传输模型。肺类器官中高效复制印证H9N2下呼吸道感染潜力，但小鼠模型未复制此现象，强调人源模型必要性。细胞嗜性差异与2,6-SA结合偏好提示分子机制需进一步探索。

病毒内部基因的适应性突变（如PB2-D253N）不仅增强H9N2自身适应，还可能通过重配贡献其他禽流感病毒（如H5N1 2.3.4.4b）的人化潜力。免疫抑制患者中病毒持久存在可加速适应性突变积累，类似SARS-CoV-2，突显宿主内进化监测重要性。系统发育显示HA、NA、PA、PB2基因已获人类适应优势，而内部基因与H3N8的紧密关联提示基因库混合风险。

研究局限包括未能获得第7天变异株进行功能验证，且仅比较单一当代与历史毒株。H9N2作为潜在大流行病原被长期忽视，其在家禽中广泛无症状传播、抗原漂移逃逸疫苗免疫、与H5N1共循环增加重配风险，均呼吁持续基因型与表型监测（尤其人类与哺乳动物感染），以评估所有禽流感病毒的 zoonotic 风险。

作者贡献

L.L.C.与K.K.W.T负责研究设计、数据收集、分析、解释与论文撰写；J.D.I.、W.M.C.、S.J.A.L.、R.C.Y.L、C.C.Y.Y.、X.J.、A.W.H.C.、H.W.T.、K.H.C.、C.H.Y.F.、L.W.、J.H.C.P.、J.Y.C.L.、K.S.L.、J.F.W.C.、H.C.、J.Z.与K.Y.Y.参与实验执行、数据收集、分析/解释；所有作者审阅并批准终稿。

致谢

感谢GISAID数据库序列提交者、小鼠实验操作人员Vincent KM Poon与Chris CS Chan。研究获香港卫生署合作项目、Health@InnoHK创新科技基金及私人捐赠资助。