基因组驱动因素导致医疗环境中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌克隆演替的机制研究

《Emerging Microbes & Infections》：Genomic driver underlies clonal shift of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in the healthcare setting

本研究通过长达15年的纵向基因组学分析，结合体外与体内实验，揭示了医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（HA-MRSA）ST239谱系衰退的进化机制。研究发现ST239谱系中特异性tarJ’基因点突变（C665??T；Thr222Ile）的累积导致细胞壁缺陷、生物膜形成能力下降、万古霉素敏感性增加及体内持久性减弱，而ST5谱系因基因组稳定性维持了表型优势。该研究为理解细菌病原体种群结构演替提供了关键的进化生物学证据。

　　

Abstract

近年来，医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（HA-MRSA）的流行病学发生了显著变化，其中ST239谱系明显衰退，而ST5谱系持续占主导地位。为阐明其进化机制，研究团队对2005年至2020年间收集的3,410株临床HA-MRSA分离株进行了纵向分析，评估克隆流行情况及基因组变化，并通过体外和体内实验（包括生物膜形成测定、抗生素敏感性测试、中性粒细胞杀伤实验和小鼠导管感染模型）进一步评估表型特征。结果显示，ST239的流行率从2005年的34.85%显著下降至2020年的0.52，同时其生物膜形成能力减弱，对万古霉素的敏感性增加。基因组分析发现ST239谱系中存在时间累积性突变，特别是tarJ’点突变（C665??T；Thr222Ile）的检测频率随着ST239流行率下降而增加，到2020年该突变在ST239分离株中固定存在（100%）。该突变导致细胞壁缺陷、酸性环境下存活率下降、生物膜形成减少以及小鼠导管模型中持久性减弱。相比之下，ST5在同一时期未出现类似的基因组退化，并保持了表型稳定性。研究表明，ST239 HA-MRSA的衰退是由突变诱导的适应性权衡所驱动，尤其影响了细胞壁完整性和持续感染能力。这些发现强调了进化约束和适应性成本如何塑造细菌病原体的种群结构。

Introduction

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）仍然是医疗相关感染（HAIs）和社区获得性感染（CAIs）的主要原因，对全球发病率和死亡率有重要贡献。MRSA的出现和传播主要受抗生素耐药基因的获取和特定序列类型（STs）的克隆扩张驱动。其中，ST239和ST5已成为两种主要的HA-MRSA克隆，因其广泛分布和公共卫生影响而受到全球关注。ST239尤其曾是多个大陆的主要HA-MRSA谱系，以其广泛的多重耐药性和频繁参与医院暴发为特征。ST239的进化特征包括获得SCCmec III型（赋予甲氧西林耐药性）和移动遗传元件编码的sasX基因（显著增强鼻腔定植、肺部感染和免疫逃逸）。这些遗传适应，加上复杂的耐药决定簇和毒力因子，促进了ST239在医院环境中的持久性和适应性。然而，最近的监测数据表明ST239的全球流行率显著下降，这可能源于感染控制措施的加强和竞争性MRSA谱系的出现。相比之下，ST5表现出显著的生态灵活性，在医院和社区环境中均能传播。其进化特征包括获得多种SCCmec类型（I, II, III），表明其对不同抗菌压力和宿主环境具有广泛适应性。这种多功能性促进了ST5的广泛传播，并模糊了HA-MRSA和CA-MRSA之间的传统界限。本研究基于先前对2008年至2017年MRSA分离株的流行病学调查，假设ST239积累了有害突变，降低了其适应性和生态适应性，而ST5保持了基因组稳定性，支持其持久性。为验证此假设，研究团队利用全基因组测序（WGS）、表型测定和实验遗传学分析了2005年至2020年间的3410株临床分离株。

Methods

Bacterial strains

研究共收集了2005年至2020年间来自中国一家三级教学医院的3,410株连续、非重复的MRSA分离株。从中选取了810株ST239和1,615株ST5非重复分离株进行最低抑菌浓度（MIC）测试，以确保广泛的时间代表性。随后，从该池中随机选择了2005年、2010年、2015年和2020年的61株ST239和65株ST5分离株（总计126株）进行进一步研究。此外，由于2020年可用的ST239菌株数量非常有限，生长曲线和生物膜形成测定中也纳入了2019年获得的两株ST239和五株ST5分离株。所有分离株的物种身份均通过MALDI-TOF MS确认，并且所有126株分离株均经确认携带mecA基因，为MRSA菌株。

Antimicrobial susceptibility testing

使用Biomerieux Vitek 2系统按照制造商说明评估所有分离株的抗菌药物敏感性。结果根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南进行判读。测试的抗菌药物包括头孢西丁（FOX）、庆大霉素（GEN）、青霉素（PEN）、头孢唑林（CZO）、利奈唑胺（LNZ）、左氧氟沙星（LVX）、红霉素（ERY）、磷霉素（FOS）、利福平（RIF）、万古霉素（VAN）和替考拉宁（TEC）。使用金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为敏感性测试的质量控制菌株。使用E-test法测定代表性金黄色葡萄球菌分离株对三种主要抗菌药物——万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺——的最低抑菌浓度（MICs）以进行验证。

Biofilm formation test

将总共63株ST239和70株ST5 MRSA分离株（分别分离自2005年、2010年、2015年、2019年和2020年）在37°C培养过夜，并使用无菌盐水调整至0.5麦氏标准。对于每个菌株，将20μL细菌悬液和180μL TSBg加入96孔微孔板的单个孔中，每个菌株三个重复。含有新鲜TSBg但不含细菌的孔作为空白对照。将板在37°C孵育48小时。孵育后，轻轻弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤孔两次。用100μL Bouin's溶液固定生物膜1小时，用100μL 2%结晶紫溶液在室温下染色1分钟，然后用蒸馏水彻底冲洗。通过测量470或570nm处的吸光度使用酶标仪量化生物膜生物量。

Whole-genome sequencing and assembly

从61株ST239和65株ST5 MRSA分离株（分别分离自2005年、2010年、2015年和2020年）在TSB中培养过夜的培养物中提取基因组DNA，使用标准的酚-氯仿提取方法，并用溶葡萄球菌素进行酶促裂解。在Illumina HiSeq 2500平台上进行全基因组测序（WGS），读取长度为150-bp双末端。使用生物分析仪对原始测序数据进行质量控制，并将高质量读数以FASTQ格式导出。此外，使用CLC默认设置将读数从头组装成重叠群。

Phylogenetic analysis

对于基于单核苷酸多态性（SNP）的系统发育分析，使用CLC Genomics Workbench将高质量读数与ST239和ST5的参考基因组进行比对。使用金黄色葡萄球菌菌株TW20作为ST239的参考基因组，使用金黄色葡萄球菌菌株N315作为ST5的参考基因组。使用CLC管道内整合的RAxML-NG v1.1.0在通用时间可逆（GTR + G + I）模型下构建最大似然（ML）树。使用1000次超快速自举重复评估分支支持度。最终树通过ITOL3可视化。树比例尺0.02表示每个核苷酸（对于蛋白质序列为氨基酸）的预期替换数为0.02。

GO enrichment analyses

将ST239和ST5分离株基因组中鉴定出的非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）注释到其相应基因上。从UniProt和Gene Ontology Consortium数据库检索基因本体（GO）功能注释。使用topGO R包和“weight01”算法以及Fisher精确检验对含有重复或时间上增加的nsSNPs的基因进行富集分析。经过Benjamini–Hochberg校正后，调整后P值< 0.05的GO术语被定义为显著富集。

Sequence type, Spa-type, and SCCmec type analysis

基于WGS数据组装的重叠群，使用基因组流行病学中心（CGE）在线工具确定ST、spa型和SCCmec型。分别使用MLST Finder 2.0和spaTyper 1.0进行MLST分型和spa分型，而使用SCCmec Finder 1.2和默认阈值（≥90%同一性，≥60%最小长度）进行SCCmec分型和mecA基因检测。

Detection of virulence factors and antimicrobial resistance genes

通过将组装的基因组与VFDB 2022和ResFinder 2020数据库进行比对，分别鉴定毒力因子和抗菌素耐药基因，使用Genomics Workbench，阈值设置为>75%同一性和>90%覆盖率。

In silico prediction of the effects of missense mutations on protein stability

为了了解基因组中非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）对结构的影响，使用DUET（一个用于研究蛋白质错义突变的集成计算方法的网络服务器）来研究和预测nsSNPs对蛋白质稳定性的影响。

Allelic gene replacement by homologous recombination and genetic complementation

为了在ST239和ST5 MRSA分离株的tarJ’基因中构建C665??T点突变，使用温敏质粒pKOR1进行等位基因替换。使用引物从没有tarJ’突变的临床分离株2005-ST239-1和2005-ST5-1中PCR扩增含有所需突变的DNA片段。通过Clonase反应将PCR产物克隆到pKOR1的attB位点，产生重组质粒pKOR1-tarJ’ (C665??T)。该质粒首先通过热激转化到大肠杆菌Top10中，然后通过电穿孔转入金黄色葡萄球菌RN4220，随后引入2005-ST239-1和2005-ST5-1。按照标准方案进行等位基因交换，并通过PCR和Sanger测序使用引物确认成功整合。使用引物组进一步通过基因组验证点突变。

Growth assay under normal and acidic conditions

将金黄色葡萄球菌菌株在TSB中培养至OD₆₀₀达到0.6（中期指数期）。将培养物稀释至OD₆₀₀ = 0.01，然后在37°C、200 rpm振荡条件下培养24小时。使用酶标仪每2小时测量一次OD₆₀₀。从所有测量值中减去仅含TSB的孔的吸光度背景值。对于酸性应激测定，细菌悬液制备方法相同，但稀释在用无菌1 M HCl酸化至pH 5.5的TSB中，接种前验证pH值。在37°C、200 rpm振荡条件下监测生长48小时，每2小时测量一次OD₆₀₀。不含细菌的TSB对照孔（pH 7.4）和酸化TSB孔（pH 5.5）作为背景对照。以OD₆₀₀对时间绘制生长曲线。

Bacterial tolerance to vancomycin killing

为了分析生物膜对抗生素杀伤的耐受性，通过在96孔微孔板中孵育48小时建立金黄色葡萄球菌生物膜。将每个谱系的代表性分离株的预形成生物膜暴露于万古霉素3小时或6小时。通过测定菌落形成单位（CFU）评估细菌存活率。0小时时间点（万古霉素处理前）的生物膜作为对照。轻轻用无菌PBS洗涤后，对生物膜层进行5分钟超声处理和15分钟涡旋以分散细菌。通过连续稀释和平板计数确定CFU计数。存活率通过将万古霉素处理后的CFU除以0小时的CFU来计算。

Biofilm observation by CLSM

如前所述量化生物膜形成。对于通过CLSM观察生物膜，生长在玻璃底培养皿中的生物膜用PBS洗涤三次，然后依次用1μM SYTO9染色30分钟，1μM碘化丙啶（PI）染色15分钟。使用Zeiss LSM 880正置激光扫描共聚焦显微镜和20倍物镜观察染色的细胞和DNA。通过ZEN lite生成三维生物膜图像。

Resistance to neutrophil killing

使用人外周血中性粒细胞分离试剂盒从健康志愿者肝素化静脉血中分离人中性粒细胞，按照制造商方案进行。对于生物膜耐受性测定，在96孔微孔板中使用TSBg培养48小时建立金黄色葡萄球菌生物膜，所有菌株使用相等的细菌接种量。然后将生物膜与新鲜分离的中性粒细胞在感染复数（MOI）约为10:1的条件下孵育。独立评估共孵育30、60和90分钟。通过CFU计数量化存活细菌。存活率通过将中性粒细胞处理后的CFU除以相应的0小时CFU来计算。实验期间研究者对分组分配设盲。

Mouse experiments

总共使用15只雌性C57BL/6小鼠进行小鼠实验。所有小鼠在使用时年龄在6至8周之间。所有动物在研究结束时通过CO₂处死。按照先前描述的方法进行导管感染模型实验。简而言之，将1厘米长的导管片段涂上相等数量的细菌，并在对照实验中测试确保数量范围相同（～1 × 10³-10⁴）。然后将导管插入小鼠背部皮肤下。感染七天后取出导管时，测定导管上和直接相邻组织上的CFU。在测定CFU时，研究者对分组分配设盲。

Statistical analysis.

使用GraphPad Prism进行统计分析和图片绘制。对于两组之间的比较，根据Shapiro-Wilk检验评估的数据分布，使用未配对的双尾t检验或Mann-Whitney检验。图中所有误差线代表标准差（SD）。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

Data availability.

所有分离株的基因组序列已存入DDBJ/ENA/GenBank，生物项目编号为PRJNA1135503。

Ethics approval

所有动物实验均获得上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会的批准（批准号：RJ2023-088A）。

Results

Longitudinal analysis of clonal prevalence, antimicrobial susceptibility, and in vitro biofilm formation in ST239 and ST5 MRSA isolates

本研究共收集和分析了3,410株连续、非重复的MRSA分离株。从2008年到2020年，观察到MRSA在所有金黄色葡萄球菌分离株中的比例呈下降趋势，从83.51%降至45.52%。在整个研究期间，ST5持续流行，从2008年到2019年每年占MRSA分离株的30%以上，尽管其流行率在2020年降至13.09%，可能是受COVID-19大流行的影响。相比之下，ST239分离株的比例显著下降，从2005年的34.85%降至2010年的24.35%，然后在2015年急剧降至7.35%，到2020年进一步降至仅0.52%。对于ST239，糖肽类抗生素万古霉素的几何平均MIC从2005年的1.26 ± 0.26 mg/L降至2020年的0.50 mg/L。而ST5分离株的MIC值在同一时期保持相对稳定，范围在0.86 ± 0.36 mg/L至0.94 ± 0.32 mg/L之间。ST239和ST5分离株对利奈唑胺的敏感性在研究期间均略有下降。

为了研究ST239流行率下降及其对万古霉素敏感性增加背后的因素，研究人员分析了总共133株MRSA分离株。采用分层抽样策略以确保时间代表性，包括2005年、2010年和2015年每个ST各20株分离株，以及2020年的1株ST239和5株ST5分离株。由于2020年ST239菌株可用性有限，额外纳入了2019年的2株ST239和5株ST5分离株，最终数据集包括63株ST239和70株ST5分离株。基于这些ST239和ST5分离株表现出相当的体外生长特性的观察，研究人员首先评估了它们的生物膜形成能力。总体而言，这些ST239和ST5分离株之间的生物膜形成没有显著差异。然而，按分离年份分层时，ST239分离株的生物膜形成随时间显著下降，而ST5分离株则显示显著增加。2005年，ST239菌株的生物膜形成显著高于ST5菌株。然而，到2015年，这一趋势发生逆转，并在2019年和2020年保持一致（由于2019年和2020年收集的分离株数量有限，将这两年的菌株合并进行统计分析）。

Genomic evolution of ST239 and ST5 MRSA isolates

为了研究这种现象的潜在机制，研究人员分析了这126株细菌的基因组信息。对这些分离株进行了系统发育分析，并鉴定了它们相关的不同毒力和抗菌素耐药基因。ST239分离株主要与spa型t030和t037相关，而ST5分离株表现出更大的多样性，包括spa型t601、t2460、t002、t311等。2005年分离的ST239菌株主要是t037，到2010年大部分被t030取代。相比之下，ST5菌株的spa型没有明显的时间关联。ST239可解析为两个系统发育亚谱系，称为ST239-A和ST239-B。将这些与更传统的spa分型进行比较，表明亚谱系与主要spa型之间存在粗略的一致性（枝ST239-A: t030, ST239-B: t037）。类似地，ST5有四个主要亚谱系，尽管在spa型分配上存在一些枝内多样性。

基因组分析揭示了不同ST之间毒力和抗菌素耐药基因的独特模式。总体而言，ST239菌株携带的抗菌素耐药基因流行率更高，而ST5菌株携带的毒力基因数量更多。在ST239中鉴定出73个毒力基因和17个耐药基因，而在ST5中鉴定出80个毒力基因和16个耐药基因。这些毒力因子与细菌粘附、效应物递送系统、外酶、外毒素和免疫调节相关。与ST5相比，ST239菌株中与粘附和免疫调节相关的基因更频繁地被鉴定出来。例如，ST239中clfA和clfB的携带率分别为60.66%和90.16%，而ST5中分别仅为1.54%和61.54%。此外，ST239携带eap/map基因，而ST5中没有。关于免疫调节基因，ST239携带cap8H-K基因，这在ST5中没有发现，而chp在ST239中缺失，但在49.23%的ST5分离株中存在。相比之下，ST5携带更多的效应物递送系统基因，包括essC, esxC, esxB, esaE, esxD, 和 esaD，这些在ST239中没有发现。在外酶和外毒素基因谱上也观察到差异：ST239携带vWbp但缺乏aur，而ST5则显示相反的模式。ST239不携带seb, sec, 或 sell，但selk和selq的携带率较高。tsst-1基因在ST239中缺失，而在87.69%的ST5分离株中存在。至于耐药基因，aadD在ST5中的检测频率高于ST239。然而，除lnu(G), lnu(A), 和 bleO外，其他耐药基因更常见于ST239菌株。

同一ST内的不同亚谱系也表现出不同的毒力和耐药基因模式。例如，只有4.76%的ST239-A分离株携带clfA基因，而90%的ST239-B分离株为clfA阳性。此外，ST239-A菌株不携带某些耐药基因。在ST5谱系内，clfB主要存在于ST5-B和ST5-D亚谱系中，而sdrC-E基因的缺失主要见于ST5-D。此外，与其他ST5亚谱系相比，ST5-A菌株携带的耐药基因更少。

ST239 MRSA have a temporal trend of increased genetic mutations

为了进一步研究MRSA菌株的基因组变化，研究人员进行了比较基因组学分析，并分析了单核苷酸变异（SNVs）的数量，包括与参考基因组不同的SNV（SNV_noref）和单核苷酸多态性（SNPs）。在ST239分离株中，每个基因组的平均SNV和SNP数量从2005年的188.43和90.68显著增加到2010年的549.29和447.59，这与ST239的初始显著下降时间吻合。这些值在2015年保持相对稳定，分别为498.00和405.80。相比之下，ST5分离株中的相应数量在同一时期保持相对稳定，约为280。对SNPs的进一步分析显示同义和非同义SNPs存在相似的趋势。热图显示了个体ST239和ST5菌株随时间的SNP差异，表明ST239菌株携带的SNP数量显著高于ST5，尤其是在2010年和2015年。

进一步的基因本体（GO）分析在ST239分离株中鉴定出22个从2005年到2010年非同义突变频率增加的基因，包括tarJ’, dltA, femA, isdE, ezrA, atpC, ctaB, hssS, 和 prsA。这些基因在与细胞壁和细胞膜、细胞质、染色体和核糖体相关的通路中富集。由于大多数突变基因与细胞壁和细胞膜相关，研究人员假设此类突变可能对ST239的进化有害。为了研究ST5中是否发生类似变化，分析了参与细胞壁和膜功能的基因的突变频率。与ST239不同，在ST5分离株中未检测到tarJ’中改变极性的非同义突变。然后，研究人员分析了本研究中收集的810株非重复ST239 MRSA分离株中tarJ’的突变基因。ST239中tarJ’突变的比例随着克隆衰退而急剧增加，从2005年的2.38%上升到2010年的61.18%。这一比例在随后的年份（2016-2018年）保持相对稳定在约40%，并最终在2020年达到100%。此外，研究发现携带tarJ’突变的ST239菌株形成了一个独特的枝（ST239-A），并且似乎已经取代了缺乏该突变的菌株（ST239-B）。因此，研究人员接下来重点研究tarJ’突变在本研究中的作用。

Identification and functional validation of tarJ’ mutation as a driver of evolution

tarJ’基因编码核酮糖-5-磷酸还原酶2，是tarJ的同源基因，催化NADPH依赖的D-核酮糖-5-磷酸还原为D-核糖醇-5-磷酸，这是壁磷壁酸（WTA）生物合成中的关键步骤。WTA对于细菌致病性和生理功能（如细胞分裂和细胞壁稳态）至关重要。在ST239中鉴定出的tarJ’突变涉及核苷酸位置665的胞嘧啶到胸腺嘧啶的替换（C665??T），导致氨基酸222处的苏氨酸（Thr）变为异亮氨酸（Ile）（T222I）。使用DUET进行的结构分析预测该突变具有去稳定性（ΔΔG = －0.214 kcal/mol），可能是由于苏氨酸的氢键被破坏以及更疏水的异亮氨酸引起的局部相互作用改变。为了评估该突变的功能影响，使用2005-ST239-1和2005-ST5-1菌株（两者均携带野生型tarJ’等位基因）构建了等基因的ST239 tarJ’ (C665??T) 和 ST5 tarJ’ (C665??T) 突变体。

鉴于tarJ’在WTA生物合成中的关键作用，研究人员首先使用透射电子显微镜（TEM）检查了金黄色葡萄球菌分离株的细胞壁形态。与ST239野生型（ST239 WT）相比，tarJ’突变体（C665??T）表现出破裂和溶解的细胞壁，表面粗糙并有大量突起。在ST5突变菌株中也观察到类似的结构改变。虽然该突变在正常条件下不影响细菌生长，但ST239和ST5 tarJ’ (C665??T) 突变体在酸性条件下8小时时的生长均显著降低。在高浓度万古霉素应激（50×MIC，3小时）下，突变菌株的存活率显著低于其各自的野生型对应株。MIC测定进一步证明tarJ’突变体对万古霉素和替考拉宁的敏感性增加（万古霉素MIC从1 mg/L降至0.5 mg/L；替考拉宁从0.5 mg/L降至0.25 mg/L），而对利奈唑胺的敏感性保持不变。值得注意的是，突变菌株的生物膜形成显著受损，通过结晶紫染色量化并通过共聚焦显微镜确认。

在评估了tarJ’突变对体外条件下金黄色葡萄球菌分离株的影响后，研究人员接下来检查了其在体内条件下的影响。在多形核中性粒细胞（PMN）杀伤实验中，tarJ’ (C665??T) 突变菌株在60分钟时表现出对中性粒细胞介导的杀伤抵抗力降低的趋势，在90分钟时观察到统计学上的显著下降。为了进一步研究体内致病性，研究人员采用了小鼠导管相关感染模型。感染tarJ’ (C665??T) 突变体分离株的小鼠与感染野生型菌株的小鼠相比，表现出减弱的致病特征，包括皮肤和粘膜下增厚减少以及炎症细胞浸润减少。感染后7天，对导管表面和周围皮肤组织（SST）的菌落形成单位（CFU）进行量化。突变菌