综述：靶向巨自噬对抗神经退行性疾病的策略与考量

《Autophagy Reports》：Targeting macroautophagy to combat neurodegenerative disease: strategies and considerations

本综述系统探讨了靶向巨自噬（macroautophagy）治疗神经退行性疾病的最新进展，重点分析了自噬体生物发生、货物捕获及自噬流降解等关键环节的调控策略（如mTORC1、AMPK、TFEB等靶点），并指出选择性自噬受体（SARs）和靶向蛋白降解（TPD）技术为特异性清除致病蛋白（如Aβ、α-Synuclein）提供了新方向。

　　

引言

自最初被发现作为应对严重营养缺乏或神经元损伤的应急通路以来，自噬对脊椎动物生存的重要性已十分明确。然而，直到研究证明基础性巨自噬在维持哺乳动物中枢神经系统（CNS）蛋白质稳态中起关键作用后，其治疗神经退行性疾病的潜力才真正显现。早期的兴奋过后，研究人员认识到自噬调控的复杂生理学、区室特异性事件的困境，以及不同细胞类型和器官对自噬依赖性的差异，使得靶向这一核心通路变得异常困难。尽管如此，对大脑和神经退行性疾病中自噬调控分子基础的研究不断深入，揭示了可能最终实现所需特异性的新靶点。本综述将概述巨自噬中可能作为治疗靶点的关键事件，并讨论设计治疗策略时的重要考量。

巨自噬：我们可以在哪些环节进行干预？

为了维持细胞稳态，自噬通路可能是最强大的：其可降解的货物范围几乎涵盖了所有细胞器。这种效力源于能够回收所有细胞大分子的溶酶体，以及自噬递送看似无限的胞质货物的能力。自噬货物可以通过分子伴侣介导的自噬（CMA）直接进入溶酶体腔，也可以通过巨自噬首先将货物包装进自噬体中间接递送。尽管CMA是治疗神经退行性疾病的一个关注靶点，但本综述将聚焦于巨自噬，因为其降解复杂大分子的能力使其成为在成人发病的神经退行性疾病中被探索具有治疗潜力的更普遍的自噬形式。

自噬体捕获货物后，会与内溶酶体系统融合以进行降解。巨自噬过程可分解为离散的步骤，这些步骤反映了自噬体自身的状态：从启动自噬体膜形成开始，接着是货物捕获、膜生长和闭合，最后是新形成的自噬体与其他内吞结构以及最终的溶酶体融合降解。每个阶段都由一组独特的分子复合物定义，其中一些为增强或削弱巨自噬功能提供了可靶向的实体基础。

自噬体生物发生与形成

利用巨自噬对抗神经退行性变最常探索的方法是增强自噬体的从头形成，以增加所需货物被降解的可能性。诱导自噬体形成的主要激酶复合物是基于酵母自噬相关基因1（Atg1）的哺乳动物直系同源物Unc样激酶1和2（ULK1/ULK2），它们中的任何一个都可以与ATG13、RB1诱导卷曲螺旋蛋白1/FAK家族相互作用蛋白200kDa（RB1CC1/FIP200）和ATG101形成多聚体激酶复合物。通过自身磷酸化和其他激酶修饰的组合，该复合物的激活可以导致自噬 machinery 被招募到自噬体形成位点。

最著名和最早的自噬激活剂是雷帕霉素（rapamycin），它抑制自噬的负调控因子——丝氨酸/苏氨酸激酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）。自这些经典研究以来，人们现在了解到mTOR以两种不同的复合物形式存在：mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2（mTORC2）。雷帕霉素抑制mTORC1并改变ULK1复合物的磷酸化状态，从而促进自噬。尽管在初级神经元中，mTORC1抑制对巨自噬激活的效力存在一些争议，但后续的小鼠研究表明，抑制这种核心营养感知激酶可以对大脑细胞中一系列自噬依赖性功能产生明显影响。在神经退行性疾病小鼠模型中，研究表明雷帕霉素及其更稳定的类似物（rapalogs）治疗可能通过增加异常积累的Tau、α-突触核蛋白和突变亨廷顿蛋白的清除而有益。然而，鉴于雷帕霉素抑制CAP依赖性翻译的能力以及用于创建转基因模型的异位表达启动子，很难区分其益处是源于自噬对蛋白质聚集体的降解增加，还是源于疾病致病转基因本身翻译的减少。

尽管雷帕霉素的使用存在疑问，其他通过修饰ULK1磷酸化来早期诱导自噬体生物发生的物质也显示出类似的成功，进一步暗示了自噬的治疗潜力。一种可能与神经元中激活自噬特别相关的激酶是参与能量感知的核心激酶——腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）。例如，使用AMPK激活剂AICAR可以产生与mTORC1抑制类似的保护作用。FDA批准的化合物，如抗惊厥药卡马西平（carbamazepine）和细胞Abelson酪氨酸激酶（c-ABL）抑制剂尼洛替尼（nilotinib），也被证明可以通过激活AMPK来激活自噬，并在阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）的小鼠模型中显示出适度的疗效。增加胞质钙离子（Ca²⁺）水平以激活Ca²⁺依赖性激酶来磷酸化ULK1（以及如下所述的自噬体成熟）是另一种诱导自噬体形成以引发保护效应的方法。总体而言，这些研究表明，在模型系统中，诱导自噬体生物发生以增加潜在的巨自噬能力可以减缓神经退行性结果的发生。然而，干预时机可能至关重要：在疾病晚期（如阿尔茨海默病）增加自噬活性可能会恶化结果，因为溶酶体功能可能已经受损，导致自噬体积累。相反，在ALS小鼠中的研究表明，早期抑制自噬会加速发病机制，而晚期抑制自噬可能具有保护作用。因此，自噬失调可能在疾病过程中发生变化，并且不同疾病的过程可能不同。此外，正如卡马西平和尼洛替尼所示，这些干预措施的多效性使得很难将任何结果 solely 归因于自噬周转的增加，从而限制了其疗效，更不用说因长期使用而引起的不良副作用。因此，与治疗不同癌症相比，使用小分子的早期大量研究并未在美国导致任何进一步明确检验自噬激活剂对抗神经退行性疾病的临床试验。

与早期普遍激活自噬的尝试相反，最近的研究聚焦于创建膜磷脂——磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P），作为诱导自噬体形成的一种更具选择性的方法。PI3P由III类PI3P激酶（PI3K）液泡蛋白分选34（VPS34）复合物产生，该复合物与辅助伙伴液泡蛋白分选15（VPS15）和Atg6同源物Beclin1（BECN1）结合。为了产生用于巨自噬的PI3P，VPS34-VPS15-BECN1与ATG14L结合，称为复合物I；而对于内吞作用，它与紫外线抗性相关基因（UVRAG）和Rubicon（RUBCN）结合，称为复合物II。复合物I进一步受核受体结合因子2（NRBF2）调控，NRBF2直接与ATG14L结合并增强其活性；而RUBCN样/与UVRAG相关的蛋白（RUBCNL/PACER）则拮抗RUBCN以利于自噬。从早期专注于（尽管效率低下）抑制Vps34本身的机制研究演变而来，最近的研究表明，通过改变特定结合伙伴的表达来调整复合物I和II之间的平衡，可以将PI3P水平转向选择性增加巨自噬。例如，过表达NRBF2可增加自噬，促进淀粉样前体蛋白C末端片段（APP-CTF）的降解，降低AD模型中的β-淀粉样蛋白（Aβ）水平并改善记忆缺陷。类似地，降低RUBCN水平可以将平衡推向复合物I，从而增加自噬体生物发生。尽管以这种方式增加自噬可能增强聚集体的周转，但研究也表明，降低RUBCN表达可以以不依赖自噬的方式增加APP/Aβ的分泌，因此对于AD风险人群可能是一种有问题的方法。在AD患者死后大脑中，已报道复合物I和II之间的平衡发生了变化，NRBF2水平降低而RUBCN水平升高。考虑到内吞作用的变化在AD早期发生，这可能反映了有利于内吞作用可能是一个早期的保护性事件。然而，RUBCN水平增加可能是衰老的一个普遍特征，因此可能是不同神经退行性疾病的共同特征。

尽管在AD中存在担忧，但在其他神经系统疾病中，将平衡从内吞作用转向自噬可能是有益的。然而，与其他基于自噬的干预措施一样，一个尚未解答的关键问题是，这种方法在症状出现后是否仍然有益，因为这是大多数患者寻求干预的时机，即使是对于遗传性疾病。如上所述，这可能取决于所研究的疾病。然而，对于蛋白质病来说，异常蛋白质积累何时开始仍不清楚，并且预防性研究的解释因不知道临床干预应何时开始而受阻。来自患者成纤维细胞直接转化的研究提示，蛋白质积累可能更接近症状出现时，而非发育早期。因此，出于治疗目的，患者很可能仅在蛋白质积累发生后才接受干预。对于RUBCN抑制，Hurley及其同事的研究已经确定了该蛋白质大部分的结构，使得合理的药物设计和潜在的后续研究成为可能，以探索这一重要的治疗问题。对于所有这些化合物，考虑到自噬和内吞作用在成年大脑不同神经细胞类型中的重要性，在成年大脑中改变自噬活性可能以内吞作用为代价，这引发了另一个关键问题：这是否可持续？例如，过表达RUBCNL/PACER可能对内溶酶体系统有害，并可能抑制自噬降解。如果蛋白质积累的速度缓慢且自噬介导的蛋白质聚集体周转高效，那么周期性激活自噬可能足以在减少不良影响的同时维持蛋白质稳态。这可能同样有助于消除慢性自噬激活的另一个关键担忧：在外周器官中的不良后果。例如，降低肾脏中的RUBCN水平可能导致代谢性疾病，而增强肌肉中的自噬会导致肌肉萎缩。鉴于老年人群是大多数神经退行性疾病的目标人群，普遍激活自噬可能会清除蛋白质病，但反过来可能增加患者在其他方面的脆弱性，恶化患者结局，这可能解释了迄今为止观察到的失败。

货物捕获

驱动自噬体生物发生的启动可能会增加自噬活性，然而，考虑到自噬降解的货物范围广泛，所需货物的捕获在某种程度上仍靠机会。相反，理解自噬如何分选和优先处理降解底物可能提供一种替代或补充方法。与泛素-蛋白酶体系统不同，自噬底物靶向的研究仍处于早期阶段。尽管如此，适配体蛋白在巨自噬引导特定货物降解的能力中起核心作用这一点已非常明确。适配体蛋白介导的货物降解被广泛称为选择性巨自噬，这源于早期研究认为巨自噬主要在紧急应激（如长期营养缺乏）下以大量、非选择性的方式降解。这些首次识别并命名巨自噬的研究源于对哺乳动物器官（如肝脏）的观察性研究。尽管对哺乳动物细胞中选择性巨自噬的研究仅在过去的二十年中有所增加，但几十年前在酿酒酵母中的发现及其在哺乳动物中的意义多年来一直被忽视。被称为细胞质到液泡靶向（Cvt），酵母依靠这条通路将氨基肽酶1（Ape1）的前酶多聚体及其他酶递送到酵母液泡中。尽管观察到与巨自噬的一些相似之处，例如形成称为Cvt囊泡的多层自噬体样结构，但Cvt曾被认为与巨自噬是分开的，因为它发生在未饥饿、营养丰富（且推测mTOR活跃）的条件下。此外，Cvt导致包装特定货物而非填充大量胞质。当明确Cvt囊泡和自噬体的形成是相同的之后，Cvt确实是自噬的一种选择性形式的认识得以巩固。同时，越来越多的研究表明，以不依赖mTORC1的方式选择性捕获货物可能是哺乳动物细胞中的常见事件，并且自噬选择性摄取货物在门类间是保守的。这些早期的观察被一个特定的命名系统所强调，该系统此后一直沿用，将自噬选择性降解的不同离散货物进行对比，例如线粒体自噬（mitophagy）针对线粒体，异源自噬（xenophagy）针对入侵病原体，聚集物自噬（aggrephagy）针对蛋白质聚集体。不幸的是，既然选择性自噬已被广泛接受，最近这种命名系统导致了混淆，使人误以为各种“-phagy”与自噬是不同的，而非表示正在被清除的货物的领域特定简写。

为了使货物被成功捕获和降解，货物必须经历标记、识别、靶向、隔离和由生长的自噬体封装。哺乳动物细胞中选择性货物捕获的核心机制从Cvt保守而来，依赖于适配体蛋白，这些蛋白将货物与自噬 machinery 以及生长的自噬体膜搭建起来。核心的适配体蛋白组，称为选择性自噬受体蛋白（SARs），其定义是存在一个泛素结合域（UBA）和一个与装饰生长自噬体膜的哺乳动物ATG8（mATG8）蛋白结合的基序，称为自噬相互作用基序（AIM）或微管相关蛋白1轻链3（LC3）相互作用区（LIR）。与Cvt的Atg19适配体蛋白非常相似，许多SARs也可以与RB1CC1/FIP200结合。在神经退行性疾病背景下最常研究的SARs包括sequestosome-1（SQSTM1/p62）、BRCA1基因邻近蛋白（NBR1）、钙结合和卷曲螺旋域蛋白2（CALCOCO2/NDP52）、tax1结合蛋白（TAX1BP1）、Toll相互作用蛋白（TOLLIP）和optineurin（OPTN）。从机制上讲，许多这些SARs，如NBR1和SQSTM1/p62，已被涉及降解多种货物，留下一些机制性问题，即这些适配体蛋白是货物特异性的，还是更大机制的一部分，通过该机制底物被识别、巩固并被自噬体捕获。

除了SARs之外，还发现了额外的适配体蛋白，可能确保货物选择性。对于蛋白质聚集体的清除，一种这样的适配体蛋白是WD重复和FYVE域包含蛋白3/自噬相关FYVE蛋白（WDFY3/Alfy），这是一种大的多域支架，对于聚集蛋白质的自噬清除至关重要。值得注意的是，它拥有一个只与GABARAP家族mATG8蛋白结合的LIR和一个与ATG5结合的WD40域，从而与mATG8膜缀合的E3样连接酶结合。然而，与SARs不同，WDFY3/Alfy没有泛素结合域，但可能与其他适配体蛋白结合以与货物相互作用，或者甚至可能以不依赖泛素的方式发挥作用，如OPTN。跨2,3-烯酰辅酶A还原酶假基因（TECPR1）也被证明可协调充满聚集蛋白质的LC3C阳性自噬体进行自噬降解。而更近期的是，E3泛素连接酶TRIAD3A（RNF216）将带有K11和K63泛素缀合的货物多聚化，以帮助运输如tau蛋白等蛋白质进行自噬降解。总之，特异性可能是通过不同分子层次的叠加来实现的，以满足不同货物的独特需求。

利用自噬特异性降解特定货物的潜力使得选择性自噬特别具有吸引力，并且在这一领域已经并持续进行着大量的努力。在最近的一项研究中，WDFY3的一个罕见变异与亨廷顿病（HD）发病年龄延迟多达23年相关。该研究发现，该变异增加了WDFY3/ALFY的表达，这足以增强聚集蛋白质的周转，并在HD、PD和tau积累的小鼠模型中赋予保护作用，表明增加适配体蛋白表达或活性足以选择性增强自噬活性。因此，促进选择性货物捕获的机制性见解不断涌现，利用这些知识的治疗方法也在不断演变。或许不出所料，磷酸化再次成为SARs（如SQSTM1）及其结合伙伴（mATG8蛋白）的翻译后修饰，以调控货物捕获和降解。几种激酶已被涉及，包括ULK1和TANK结合激酶1（TBK1）。鉴于适配体蛋白介导的摄取在异源自噬中的重要性，TBK1将其在先天免疫中的核心作用与自噬互补是有些令人满意的。TBK1以及OPTN和SQSTM1/p62的功能缺失突变也已在ALS中被识别，从而使其和PD成为两种货物捕获（尤其是线粒体）可能特别失调的疾病。对TBK1功能丧失的兴趣揭示了在成年CNS背景下可能重要的另一个考量——改变激酶功能时，哪种细胞类型将最受影响，神经元还是胶质细胞。然而，使用小分子方法普遍诱导这些通路仍然受到多效性作用的困扰。

一个日益增长的、可能克服这一问题的途径是使用靶向蛋白降解（TPD）技术。这些技术依赖于创建一种双功能分子，诱导货物与功能性部分（如E3泛素连接酶）接近，以增加相互作用的可能性，从而加速过程。这种方法对于非酶靶点或超出传统小分子范围的靶点可能特别有价值。最初为促进E3泛素连接酶识别货物以促进有效的蛋白酶体降解而开发，基于蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）的方法启发了也通过其他降解途径（包括自噬）靶向货物的设计。自噬靶向嵌合体（AUTACs）、自噬体拴系化合物（ATTECs）和自噬靶向嵌合体（AUTOTAC）是设计的异双功能小分子，可将感兴趣的靶点与形成中的自噬体内表面结合或促进与SAR的相互作用。这些不同的化合物利用不同的货物标记物，如泛素化底物，以及功能性部分，如mATG8蛋白或SARs（如SQSTM1）。

鉴于这些方法的分子定义性质，自噬TPD方法的发展进一步强调了阐明货物选择性分子基础的重要性，以确保只有所需的货物被捕获以进行清除。这些方法的特异性对于神经退行性疾病尤其令人兴奋，因为它们可以被设计成对每种疾病具有特异性。例如，感兴趣的靶点可能是疾病相关蛋白的可溶性形式或聚集形式，或特异性片段化的线粒体。尽管这项工作仍处于起步阶段，几种基于PROTAC的方法正在进入癌症的临床试验。然而，与许多对抗脑部疾病的创新方法一样，TPD方法的主要限制是递送，这是一个活跃的研究领域。

自噬流与降解

自噬最后也是最重要的步骤是货物的成功降解，这是通过自噬体与溶酶体融合实现的。自噬体闭合后（多个蛋白质复合物被涉及，最显著的是ESCRT machinery 和VPS34复合物I），确保完全降解对于任何自噬治疗方法都可能至关重要。这对于如溶酶体贮积症和AD等疾病可能特别重要，在这些疾病中，使溶酶体超负荷可能导致自噬体本身的积累。此外，底物在自噬体中的积累可能通过自噬体胞吐驱动非常规分泌，从而将内容物释放到细胞外空间。这不仅对病毒可能是可怕的，而且对路易体和tau病理的传播也是如此。

协调自噬-溶酶体通路的核心是转录因子EB（TFEB），它是小眼畸形（MiT/TFE）亮氨酸拉链转录因子家族的成员，是一个核心转录调节因子，协调从适配体蛋白p62到溶酶体成分的各种转录。靶向TFEB在神经退行性疾病模型中（尤其是在溶酶体功能障碍已被涉及的帕金森病中）在实验上具有保护作用。在单独的研究中，过度激活与癌症有关，导致肾毒性和其他脱靶事件，表明在考虑治疗神经退行性疾病可能需要的长期治疗策略时应谨慎行事。诸如周期性治疗等可以减轻蛋白毒性应激的策略可能是有益的，并避免这些不良后果。

细胞内Ca²⁺作为激活TFEB和自噬溶酶体融合的一种手段已被注意到。一个例子是粘脂素TRP阳离子通道1（MCOLN1）。小鼠神经元中的研究表明，消耗MCOLN1会导致自噬受损，其特征是p62/泛素阳性包涵体的积累，表明该通道可能在自噬中起重要作用。该通道已在ALS背景下作为治疗靶点进行测试，其增加的激活在病理和行为上显示出神经保护作用。双孔通道2（TPC2）是另一个因其在pH稳态中的重要性而被识别的离子通道。尽管在药理学上取得了进展，使这些通道成为神经退行性疾病的可成药靶点，但关于这些方法实现货物高特异性的能力的问题仍未得到解答。这进一步说明了利用多种方法将不同分子靶点分层可能对于同时利用货物特异性和降解效率是必要的。

结论

将自噬视为维持大脑蛋白质稳态的基础性作用的里程碑式研究，几乎立即引发了兴奋，即增强这一高度保守的通路可能代表神经退行性疾病与治愈之间缺失的一环。然而，鉴于自噬在维持所有细胞稳态中的核心作用，早期的尝试令人失望。但自那时起，我们不仅对货物捕获的分子基础有了更深入的了解，为选择性利用自噬的力量提供了一个新的抓手，而且诸如TPD之类的新技术已经出现，可能允许以新颖的方式探索非传统靶点。总体而言，尽管这些发展充满希望，但仍缺乏关键观察结果来证明靶向自噬活性足以对神经退行性疾病的进程产生治疗影响。例如，虽然在症状出现之前通过遗传或化学方法增加自噬活性可以起到预防作用，但在有症状的动物中是否仍能实现治疗价值（大多数患者会在此时期寻求治疗）在很大程度上仍不清楚。此外，鉴于年龄是神经退行性疾病和自噬活性的一个重要变量，衰老如何影响自噬的效力及其被修饰的能力应在实验设计中得到更积极的考虑。获得此类问题的答案将使我们能够更好地理解如何利用自噬的力量来对抗这些毁灭性疾病，并确保更好地设计要采用的治疗策略。