利用液体覆盖技术生成的3D细胞培养物的形态学特征分析

《Biotechnic & Histochemistry》：Morphological characterization of 3D cell cultures generated by liquid overlay technique

3D细胞球状体形态随细胞数量、培养时间及固定方法的变化规律研究。使用液态覆盖技术（LOT）培养不同数量（10,000-200,000）正常人类真皮成纤维细胞（NHDF），通过光镜、扫描电镜和数字光镜分析显示：高细胞数（>50,000）培养物易形成中心凹陷的3D细胞聚集体，且PFA和GDA/脱水固定显著降低球状体比例。数学模型（RM2=0.39e^(-0.15t)+0.62）显示球状体直径随时间呈指数衰减。建议高细胞数球状体培养≥3天以稳定形态，并避免醛类固定剂对早期形态的影响。

　　本研究聚焦于三维细胞培养技术（3D cell culture）在细胞生物学和医学研究中的应用。传统的二维细胞培养（2D cell culture）虽然为科学研究提供了基础平台，但其局限性逐渐显现，特别是在模拟真实组织环境方面。三维细胞培养技术被认为能够更准确地反映细胞在体内的自然生长状态，因此在制药、组织工程、血管生成等研究领域得到了广泛的应用。然而，三维细胞培养的分析手段与传统二维培养相比存在一定的挑战，尤其是在形态学研究方面。本研究通过使用液态覆盖技术（Liquid Overlay Technique, LOT）生成不同细胞数量的正常人真皮成纤维细胞（Normal Human Dermal Fibroblasts, NHDF）三维培养体系，并在培养后第1、2、3天对这些细胞的形态变化进行分析，探讨了细胞数量、培养时间以及固定方法（如戊二醛/脱水处理和多聚甲醛固定）对三维细胞形态的影响。

在三维细胞培养过程中，细胞在无支架的条件下通过自组装形成结构。这种技术的关键在于，通过在96孔板的孔中涂覆一层细胞排斥性琼脂糖，使得细胞无法附着于孔底，从而在培养过程中相互聚集形成三维结构。研究显示，不同细胞数量的培养物在形成过程中表现出不同的形态特征。例如，当每孔仅种植10,000个细胞时，培养物在培养后的第一天几乎全部呈现为规则的球形结构，而当细胞数量增加到200,000个时，形态则明显变得更加不规则，呈现出明显的凹陷特征。这种凹陷现象可能与细胞在培养过程中因数量过多而形成多层结构有关，从而影响了其整体形态。

本研究采用多种显微成像技术对三维细胞培养物的形态变化进行了详细分析，包括明场显微镜、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）以及数字光显微镜（Height Profile Measurement）。通过这些技术，研究人员能够观察到细胞在不同时间点的形态变化，并结合数学模型对细胞培养物的体积变化进行了定量描述。结果显示，随着培养时间的延长，三维细胞培养物的尺寸逐渐减小，这种变化可以用指数衰减函数来描述。此外，固定方法对细胞形态也有显著影响，特别是使用戊二醛和脱水处理的固定方式，可能会导致细胞结构的进一步变化，从而影响形态的判断。

在培养初期，较小的细胞群体（如10,000个细胞）通常能够保持较为稳定的球形结构，而随着细胞数量的增加，尤其是在200,000个细胞的情况下，培养物的形态变得更加复杂，呈现出明显的凹陷。这种现象可能与细胞之间的相互作用、细胞外基质的形成以及固定过程中发生的化学反应有关。研究人员还发现，固定后的细胞培养物在形态上可能与活体细胞培养物存在差异，这可能是因为固定过程改变了细胞的结构稳定性，进而影响了其形态特征的呈现。

为了进一步验证这一假设，研究团队对不同细胞数量的三维培养物进行了SEM分析。结果表明，随着培养时间的延长，较大的三维培养物逐渐发生结构重组，凹陷区域逐渐减少，最终呈现出更接近球形的形态。这一过程可能与细胞之间的相互作用增强、细胞外基质的合成以及细胞迁移等因素有关。值得注意的是，即使在培养后的第三天，部分较大的培养物仍然表现出一定程度的凹陷，这表明其结构变化是一个渐进的过程，而不是在短时间内迅速完成的。

本研究还探讨了固定方法对细胞形态的影响。结果显示，对于10,000个细胞的培养物，无论采用哪种固定方式，其形态变化都相对较小，且大部分仍能保持球形结构。然而，当细胞数量增加到50,000个或以上时，固定处理（尤其是戊二醛/脱水）显著降低了球形结构的比例，增加了凹陷结构的数量。这可能是因为固定过程中发生的蛋白质交联反应改变了细胞的物理特性，从而影响了其形态稳定性。此外，研究还发现，随着时间的推移，固定对细胞形态的影响逐渐减弱，这表明细胞在培养过程中可能会逐渐适应固定条件，或者其结构变化主要发生在培养初期。

综上所述，本研究揭示了三维细胞培养过程中细胞数量、培养时间和固定方法对细胞形态的综合影响。通过LOT技术，研究人员能够生成高度可重复的三维细胞结构，但这些结构在形态学分析时仍需谨慎处理，特别是在固定过程中。未来的研究可以进一步探讨不同固定方法对细胞功能和结构的具体影响，以及如何优化三维细胞培养条件以提高其在生物医学研究中的应用价值。此外，三维细胞培养技术在组织工程和药物筛选中的潜力仍需进一步挖掘，以推动其在实际应用中的发展。