体内自组装纳米PROTAC实现AR与HSP90双重降解以克服去势抵抗性前列腺癌耐药

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：In vivo self-assembled nano-PROTAC for the dual degradation of AR and HSP90 to overcome castration-resistant prostate cancer resistance

本研究针对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对第二代雄激素靶向治疗的耐药难题，开发了一种PSMA靶向的纳米PROTAC（Psa-AR）。该药物通过体内自组装技术，不仅能精准降解雄激素受体（AR），还能巧妙降解与AR紧密结合的热休克蛋白90（HSP90）。在22Rv1细胞模型中，Psa-AR可降解80%的AR蛋白和65%的HSP90蛋白，并对耐药相关的AR剪接变体AR-V7降解率达74%。在恩杂鲁胺耐药的小鼠模型中，Psa-AR表现出高达78%的肿瘤生长抑制率和15天的中位生存期延长，为PSMA和AR阳性的CRPC（除神经内分泌前列腺癌外）提供了新的治疗策略。

　　

前列腺癌是全球男性第二常见的恶性肿瘤，其中10-20%的晚期患者会在5年内发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。尽管第二代雄激素受体靶向药物（如恩杂鲁胺和阿比特龙）显著改善了患者的无进展生存期和总生存期，但晚期患者的5年生存率仍低于30%。CRPC患者一旦发生转移，平均生存期不超过2年，成为临床治疗的重大挑战。耐药的主要机制包括雄激素受体剪接变体（如AR-V7）的出现和分子伴侣热休克蛋白90（HSP90）的稳定作用，后者能协助AR正确折叠并维持其构象稳定性。传统的HSP90抑制剂（如17-AAG）因严重的系统毒性和药代动力学缺陷未能成功应用于临床，而蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）技术虽能高效降解AR蛋白，但对AR-V7的效果较弱。

为此，研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表了基于体内自组装纳米技术的研究，设计了一种具有邻近降解效应的PSMA靶向纳米PROTAC（Psa-AR）。该研究利用患者组织样本验证了E3连接酶CRBN的高表达（83.3%的肿瘤细胞），并通过模块化设计将PSMA靶向配体、自组装肽、AR结合模块和CRBN招募配体整合，实现了肿瘤特异性的细胞内化后自组装成β-片层纳米纤维。这种结构不仅能降解AR，还能利用其纳米结构的空间自适应特性降解与AR紧密结合的HSP90。

研究采用的关键技术包括：基于微尺度热泳动（MST）的结合亲和力测定、临界组装浓度（CAC）分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和透射电镜（TEM）表征组装行为，以及体外和体内的蛋白降解、细胞凋亡和抗肿瘤功效评估。此外，还利用免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和Western blot（WB）对临床样本和模型动物进行了分子验证。

Nano-PROTAC design and functional validation

研究人员设计了PSMA靶向的Psa-AR及其无自组装结构域的对照P-AR，并通过HPLC和MALDI-TOF-MS验证了化学结构。MST显示Psa-AR与PSMA的结合亲和力（K_d=7.2 nM）较高，PSMA结合后其CAC降低8.76倍，组装动力学加速（t_1/2从11.4小时缩短至1.4小时）。FTIR和TEM证实PSMA结合驱动了β-片层主导的纳米纤维形成，而P-AR则无此行为。细胞实验表明，Psa-AR在PSMA高表达的22Rv1细胞中膜定位和细胞内化效率比P-AR高5倍，且主要定位于细胞质，具备核积累潜力。

Nano-PROTAC-mediated protein interaction and degradation

MST证明Psa-AR能同时结合AR和CRBN（亲和力分别为0.95 μM和1.06 μM），并在AR存在下维持对CRBN的亲和力（1.14 μM）。IF显示Psa-AR可富集HSP90并形成AR:Psa-AR:CRBN三元复合物。WB表明，在22Rv1和LNCaP细胞中，Psa-AR降解了80%的AR和65%的HSP90，且效果优于P-AR（降解率提高45%），并依赖蛋白酶体（MG-132可抑制80%降解活性）。Psa-AR的降解具有浓度和时间依赖性（40 μM时降解80% AR，96小时内维持99% knockdown），且对PSMA敲低细胞无脱靶效应。此外，Psa-AR还能降解74%的AR-V7，并通过诱导凋亡（Annexin V/PI染色显示75%凋亡细胞）和降低IC₅₀（10.9 μM vs P-AR的95.8 μM）显著抑制细胞生长，而对正常RWPE-1细胞无毒性。

Nano-PROTAC biodistribution evaluation

临床样本分析显示，CRPC患者治疗后AR下调伴随PSMA上调，建立了自我放大的靶向循环。体内成像表明，Cy7标记的Psa-AR在22Rv1移植瘤小鼠中肿瘤积累比P-AR高4倍，24小时后保留78%信号，且肿瘤与肝、肾的信号比分别为2.8:1和4.6:1，显示出优异的肿瘤选择性和保留效应。

In vivo protein degradation and antitumor efficiency of the nano-PROTAC

在22Rv1移植瘤模型中，Psa-AR（20 mg/kg）治疗组的肿瘤体积（347 mm3）显著小于P-AR（773 mm3）和PBS组（1003 mm3），肿瘤生长抑制率（TGI）达65%，中位生存期延长至48天（PBS为22天）。IF证实肿瘤组织中AR和HSP90的协同降解，TUNEL染色显示凋亡指数增加。剂量效应实验表明，10-30 mg/kg Psa-AR可剂量依赖性地抑制肿瘤生长并降解AR和HSP90，且无体重减轻或毒性。与恩杂鲁胺、pimitespib单药或联合治疗相比，Psa-AR的抗肿瘤效果更优（肿瘤体积220 mm3 vs 联合组的631 mm3），生存期延长（46天 vs 联合组的31天）。

In vivo biocompatibility evaluation of the nano-PROTAC degradation system

在健康BALB/c小鼠中，Psa-AR（30 mg/kg）处理后，H&E染色显示主要器官无病理变化，血清生化（ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLOB、BUN、CRE）和血常规（WBC、NEU、LYM、RBC、PLT、HGB、MPV）指标无显著改变，证实了良好的生物相容性。

该研究开发的Psa-AR通过PSMA介导的靶向和自组装实现了AR和HSP90的双重降解，有效克服了CRPC的耐药性，尤其是对AR-V7的降解展现了突破传统疗法的潜力。纳米结构形成的正反馈循环增强了肿瘤积累和保留，而模块化设计为拓展其他癌症靶点提供了通用策略。这一成果不仅为前列腺癌治疗提供了新途径，也为纳米PROTAC的临床转化奠定了坚实基础。