异荭草素通过调节肠道微生物及其代谢物经P-gp/eCBs通路降低肠道通透性缓解Caco-2细胞单层炎症

《Journal of Inflammation Research》：Isoorientin Modulates Gut Microbes and Their Metabolites to Alleviate Caco-2 Cell Monolayer Inflammation by Reducing Intestinal Permeability via P-Gp/eCBs

本文研究了天然黄酮类化合物异荭草素（ISO）在体外通过调节肠道菌群代谢物缓解肠道炎症的新机制。研究发现，ISO处理后的肠道菌群上清液能显著改善脂多糖（LPS）诱导的Caco-2细胞单层屏障损伤，表现为跨上皮电阻（TEER）值升高、FITC-葡聚糖通透性降低，并恢复紧密连接蛋白（Occludin, ZO-1）的表达。其作用机制与调控P-糖蛋白（P-gp）和内源性大麻素系统（eCBs）相关蛋白（如CB2受体）的表达有关，提示ISO通过P-gp/eCBs信号通路增强肠道屏障功能、减轻炎症反应，为炎症性肠病（IBD）的治疗提供了新的潜在策略和实验依据。

　　

引言

炎症性肠病（IBD）是一种由肠道菌群引起的炎症性损伤，好发于存在肠上皮屏障（IEB）功能障碍的遗传易感个体。肠上皮细胞（IECs）是维持肠黏膜屏障完整性的主要角色。受损的IEB是导致IBD及其他肠道相关炎症性疾病发生的关键因素。在IBD的病理状态下，细菌、病原体及其他抗原等不同致病因素可能触发IECs过度产生炎症因子，进而导致肠道炎症失控。肠黏膜屏障因IECs损伤而缺失，使得肠腔内大量菌群直接接触肠黏膜，导致细菌从肠腔易位至血液和器官，进而引发全身炎症反应。

IEB的完整性在很大程度上取决于顶端的多蛋白结构——紧密连接（TJ）蛋白。这些TJ在侧膜顶端连接相邻的上皮细胞，将跨膜蛋白与细胞内肌动蛋白细胞骨架相连。这种相互作用对于控制旁细胞通透性和确保上皮层的稳定性至关重要。IECs中TJ的表达和分布受到一系列细胞内和细胞外因素的影响，包括炎症细胞因子、肠道微生物及其代谢物。这些因素在调节TJ功能中扮演着动态角色。由于不同病原体引起的IEC TJ屏障损伤通过增加肠道通透性促进了IBD的发展，因此通过维持IECs的屏障功能来预防肠道疾病是必要且尤为重要的。

脂多糖（LPS）是引发肠道和全身炎症的关键因素。研究表明，LPS破坏TJ结构，并直接或间接通过分泌细胞因子和炎症介质诱导黏膜通透性过高。此外，持续的炎症刺激导致肠道TJ屏障功能受损，进而产生促炎细胞因子，形成恶性循环。相关研究表明，肠道微生态紊乱可产生如LPS等强炎症物质，增加IEB通透性，导致“肠漏”，使多种致病物质逃逸至外周循环系统，引起全身炎症。因此，旨在最小化炎症反应的策略可能成为治疗IBD的潜在疗法。多项体外研究表明，天然化合物（如维生素A）可以逆转LPS诱导的肠道屏障损伤。乳香和姜黄提取物对肠上皮具有保护作用，表现为与LPS处理的细胞相比，跨上皮电阻（TEER）值升高。此外，固定化益生菌和草药提取物的组合可防止炎症引起的TEER降低、旁细胞通透性增加和TJ蛋白易位。芍药苷显著提高了LPS暴露后Caco-2细胞的TEER水平，降低了FITC-葡聚糖通量通透性，并恢复了Occludin、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和Claudin-5的表达。

肠道的正常功能依赖于由单层IECs形成和维持的黏膜屏障。正常肠道菌群的形成对于该上皮屏障的发育和持续维护至关重要。越来越多研究表明，肠道菌群在IBD肠道炎症的发生和进展中起关键作用。寄生在机体肠道内的大量微生物构成了肠黏膜的生物屏障，并在正常肠道环境中维持动态平衡。这些微生物及其代谢物短链脂肪酸（SCFAs）的产生在维持肠道屏障方面发挥着重要作用。已有报道一些创新的治疗策略旨在有效恢复IEB完整性。例如，张等人报道了单宁酸和锌离子配位纳米酶通过清除活性氧和氮物种来治疗IBD。此外，具有肠道黏膜免疫和微生物群稳态重塑功能的CO释放多金属氧酸盐纳米酶能够恢复IEB完整性。

黄酮类化合物是人类饮食的重要组成部分，广泛存在于多种可食用植物中。膳食黄酮类化合物在肠道细菌作用下的代谢转化可能对人类健康产生潜在益处。异荭草素（ISO）是一种天然存在的C-糖基黄酮，已显示出多种药理作用。我们前期的研究发现，ISO能够缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎，并对结肠炎小鼠的肠道微生物及其代谢物具有调节作用，显著增加肠道微生物代谢物SCFAs和次级胆汁酸（SBAs）的含量，并调节P-糖蛋白（P-gp）表达以缓解结肠炎症。肠道内SCFAs和SBAs的产生在治疗结肠炎症中很重要，也可能在维护肠道屏障完整性方面发挥重要作用。

内源性大麻素系统（eCBs）与炎症的产生和消退密切相关。P-gp是一种具有广泛底物特异性的跨膜泵，能够平衡eCB系统中相关受体蛋白的表达，从而参与炎症过程。调节P-gp/eCB轴并增加P-gp表达可减少肠道炎症，从而降低IEB通透性。在本研究中，通过LPS诱导Caco-2细胞体外模拟IEB炎症模型，并将ISO调节的肠道粪便上清液与Caco-2细胞模型共培养。研究了ISO调节的肠道微生物代谢物对炎症反应和P-gp/eCB轴相关蛋白表达的影响，为ISO通过肠道微生物代谢物调节P-gp表达、降低肠道通透性和调节肠道屏障以缓解结肠炎提供了实验基础。

材料与方法

材料

ISO纯度≥98%，由中国科学院（上海）提供。使用21只6-7周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠（体重18-20g）。LPS、细胞培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶/EDTA、抗生素、抗体等试剂购自指定公司。

动物实验

将C57BL/6小鼠随机分为对照组（CON）、模型组（DSS）和ISO组（n=7）。所有小鼠前7天饮用正常水。在第二个7天，除CON组外，其余组小鼠自由饮用2.5% DSS溶液，实验周期共14天。在整个实验期间，ISO组通过灌胃给予50 mg/kg/天的ISO，而CON组和DSS组给予等剂量的0.5% CMC-Na溶液。在给药最后一天，分别采集各组小鼠粪便，于-80°C保存。

粪便上清液制备

根据既定方案制备小鼠粪便上清液。新鲜采集的粪便样本称重后，用无血清生长培养基重悬至0.25 g/mL浓度，匀浆后于10,000×g离心15分钟，上清液经0.22 μm滤膜无菌过滤，并用无血清DMEM高糖培养基稀释，用于细胞实验。

细胞培养

人肠上皮Caco-2细胞（ATCC）在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM中于37°C、5% CO₂条件下培养。培养基每2天更换一次。细胞单层生长在胶原包被的6孔板中，接种后7-9天用于诱导炎症反应。在加入粪便上清液、5 mM丁酸或50 μM脱氧胆酸（DCA）、熊去氧胆酸（UDCA）和石胆酸（LCA）前，细胞用无血清DMEM饥饿培养12小时。干预24小时后收集细胞进行分析。

细胞活力测定

使用CCK-8法检测细胞活力。将Caco-2细胞以1×10⁴细胞/孔接种于96孔板，培养24小时后，分别用不同浓度的LPS（0, 0.1, 1, 10, 20, 50 μg/mL）或不同组别的粪便上清液（0, 1, 10, 25, 50 mg/mL）处理24小时。弃去上清，加入CCK-8溶液，孵育2小时后于450 nm波长测量吸光度，计算细胞活力。每个实验重复5次。

ELISA

将Caco-2细胞以2.5×10⁵细胞/mL密度接种于6孔板，培养至汇合。然后加入粪便上清液（10 mg/mL）和/或LPS（10 μg/mL）。干预结束后，吸取细胞培养上清液，使用ELISA试剂盒检测细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-6水平。

逆转录定量PCR（RT-qPCR）

使用TRIzol试剂从2×10⁵培养细胞中提取总RNA。用M-MLV逆转录酶从1 μg RNA合成cDNA。使用SYBR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95°C 30秒初始循环，随后95°C 15秒、60°C 30秒，共45个循环。通过熔解曲线分析产物特异性。每个样本设3个复孔，目标转录本CT值以内参基因GAPDH标准化，采用2^-ΔΔCq法计算基因相对表达量。通过qPCR检测促炎标志物TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量，以确定粪便上清液的抗炎状态。

TEER和通透性测量

将生长状态良好的Caco-2细胞消化制备细胞悬液，以1×10⁴细胞/mL浓度接种于24孔Transwell板（聚碳酸酯膜，孔径0.4 μm），顶室（AP）加200 μL细胞悬液，底室（BL）加600 μL完全培养基，于37°C、5% CO₂培养21天。然后向顶室培养基中加入不同组别的粪便上清液，有或无LPS（10 μg/mL）共同孵育24小时。TEER测定如前所述进行。将Caco-2细胞单层两室的培养基更换为PBS，向Transwell顶室加入0.1 mg/mL FITC-葡聚糖。与FITC-葡聚糖孵育1小时后，收集Transwell底室的培养基。使用荧光酶标仪（激发光480 nm，发射光520 nm）定量荧光强度。

蛋白质印迹（Western Blotting）

细胞使用含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液裂解，BCA蛋白法定量蛋白浓度。每个样本蛋白通过10-13%丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE分离，随后转移至PVDF膜。膜上蛋白用5%脱脂牛奶封闭1小时，然后与针对GAPDH、TJ蛋白ZO-1、Occludin、P-gp和CB2的一抗4°C孵育过夜。洗膜后，与相应的二抗室温孵育1小时。使用Al600成像系统检测条带强度，Image J软件进行量化。

细胞免疫荧光测定

将细胞在24孔板内的盖玻片上培养24小时。随后，用PBS洗涤细胞三次，4%多聚甲醛固定15分钟，5%牛血清 albumin 37°C封闭1小时。PBS洗涤后，加入ZO-1和Occludin一抗，4°C湿盒孵育过夜。洗涤后，加入Alexa Fluor^? 488标记的二抗，室温避光孵育2小时。细胞核用DAPI染色。最后进行荧光显微镜观察，每张玻片随机选择三个视野。

统计分析

数据以均值±标准误表示。使用GraphPad Prism进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey事后检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

结果

ISO处理的小鼠粪便上清液对Caco-2细胞活力的影响

为确定ISO处理的小鼠粪便上清液对LPS诱导的Caco-2细胞毒性的修复作用，首先评估了粪便上清液或LPS对Caco-2细胞活力的细胞毒性。CCK-8结果表明，与未处理细胞相比，浓度为25 mg/mL的粪便上清液孵育24小时后显著降低细胞活力。LPS在10 μg/mL浓度下影响细胞活力。表明粪便上清液在浓度≤25 mg/mL、作用24小时对Caco-2细胞无毒性。因此，后续实验使用10 mg/mL粪便上清液和10 μg/mL LPS。

接下来，将不同处理组小鼠粪便上清液与LPS处理的Caco-2细胞共孵育24小时后的结果显示，与LPS组相比，ISO处理组（ISO-FST）和对照组（CON-FST）小鼠粪便上清液显著逆转了LPS引起的Caco-2细胞活力降低，而DSS处理组（DSS-FST）粪便上清液无此效果。同时，与DSS处理组相比，ISO处理的小鼠粪便上清液完全逆转了LPS刺激导致的细胞活力降低。

为进一步探索ISO调节的肠道微生物代谢物是否具有抑制结肠炎的生物活性，研究了ISO处理的小鼠粪便上清液对Caco-2细胞的抗炎作用。结果显示，LPS刺激后Caco-2细胞促炎因子IL-6和TNF-α的表达增加，ISO处理组粪便上清液显著降低了LPS诱导的Caco-2细胞分泌到培养基中的IL-6和TNF-α，而DSS处理组未降低Caco-2细胞炎症细胞因子的分泌。RT-qPCR检测IL-6和TNF-α mRNA表达变化结果显示，LPS刺激增加了细胞中IL-6和TNF-α的mRNA水平，DSS组粪便上清液处理加剧了此效应，而ISO组粪便上清液逆转了这些上调。表明ISO处理的小鼠粪便上清液能够减轻LPS刺激的Caco-2细胞炎症反应。

ISO处理的小鼠粪便上清液对LPS诱导的Caco-2单层细胞通透性的影响

采用TEER评估Caco-2细胞单层完整性。当TEER值>200 Ω/cm²时，认为细胞单层完整且TJ形成。TEER值随培养时间延长逐渐增加，第9天达到平台期，至第11天TEER值达到1188 Ω/cm²。

为确定不同处理小鼠粪便上清液对单层Caco-2细胞通透性的影响，使用FITC-葡聚糖通透性实验检测Caco-2细胞对大分子溶质的通透性。结果显示，LPS刺激诱导后，Caco-2细胞的FITC-葡聚糖通透性增加，与CON组相比FITC-葡聚糖浓度显著升高。此外，与CON组和DSS粪便上清液组相比，ISO粪便上清液组处理显著降低了LPS刺激诱导的FITC-葡聚糖渗漏。

ISO处理的小鼠粪便上清液对LPS诱导的Caco-2细胞中ZO-1和Occludin的影响

Western Blotting检测LPS对Caco-2细胞ZO-1和Occludin表达影响的结果显示，10–50 μg/mL LPS显著降低了Caco-2细胞中ZO-1和Occludin的表达，与对照组相比差异有统计学意义，其中10 μg/mL LPS效果显著，表明LPS可在一定程度上破坏Caco-2细胞间的TJ结构。

为研究ISO处理的小鼠粪便上清液对LPS诱导的Caco-2细胞TJ结构破坏的影响，检测了Caco-2细胞中ZO-1和Occludin的表达。Western Blotting结果显示，LPS组Caco-2细胞TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达显著降低，表明Caco-2细胞TJ结构被破坏，而ISO粪便上清液处理组处理后Occludin和ZO-1的表达得以恢复。同时，与DSS处理组相比，ISO组也显著增加了Occludin和ZO-1的表达，表明ISO处理的小鼠粪便上清液可显著修复LPS诱导的Caco-2细胞TJ结构破坏。此外，ZO-1和Occludin免疫荧光分析结果与Western Blotting结果一致。这些数据表明，ISO粪便上清液通过抑制LPS诱导的Caco-2细胞TJ蛋白丢失来维持Caco-2细胞完整性。

ISO处理的粪便上清液对Caco-2细胞中P-gp/eCB相关蛋白的影响

接下来通过Western Blotting研究了Caco-2细胞中P-gp/eCB相关蛋白的表达。结果显示，LPS刺激诱导后，Caco-2细胞中P-gp和CB2蛋白的表达显著降低，而用ISO粪便上清液（10 mg/mL）处理显著逆转了上述反应，增加了P-gp和CB2的表达。此外，与DSS组处理相比，ISO粪便上清液处理组显著增加了P-gp和CB2的表达。这些结果表明，ISO粪便上清液可能通过调节P-gp/eCB轴相关蛋白的表达来改善LPS诱导的Caco-2细胞单层炎症。

ISO调节的微生物代谢物通过调控P-gp/eCBs缓解LPS诱导的Caco-2细胞结构损伤和炎症反应

前期结果发现ISO处理的小鼠粪便上清液对LPS诱导的受损Caco-2细胞炎症具有修复作用，且与P-gp/eCB相关蛋白表达下降高度相关。同时，前期实验表明ISO调节的小鼠肠道菌群代谢物主要包括丁酸、脱氧胆酸、石胆酸和熊去氧胆酸。为验证ISO调节的肠道菌群代谢物能否通过增强P-gp/eCB相关蛋白的表达，从而实现对Caco-2细胞TJ结构的修复作用及炎症反应的减轻，实验使用P-gp蛋白抑制剂维拉帕米以及不同浓度的化学丁酸、DCA、LCA和UDCA单独或联合处理LPS诱导的Caco-2细胞。观察了ISO调节的微生物代谢物对LPS诱导的Caco-2细胞炎症及TJ蛋白ZO-1和Occludin表达的影响。

结果显示，P-gp抑制剂维拉帕米不能改变LPS刺激的Caco-2细胞炎症反应，而ISO调节的四种主要微生物代谢物显著降低了Caco-2细胞中IL-6和TNF-α的分泌。提示ISO调节的P-gp表达影响Caco-2细胞的炎症反应。

Western Blotting显示，ISO调节的微生物代谢物显著改善了LPS诱导的ZO-1和Occludin表达降低，且四种主要代谢物联合使用对Caco-2细胞中ZO-1和Occludin表达的升高作用更为明显。此外，ISO调节的微生物代谢物对P-gp/eCBs相关蛋白表达的影响结果显示，微生物代谢物联合使用显著增加了LPS刺激的Caco-2细胞中降低的P-gp和CB2蛋白表达，即使在使用了P-gp抑制剂维拉帕米后也是如此。值得注意的是，与单一代谢物相比，四种主要代谢物的联合干预在Caco-2细胞模型中对ZO-1和Occludin表达的上调表现出显著的协同效应。该结果得到免疫荧光实验的证实：代谢物处理组能有效改善LPS对紧密连接蛋白（ZO-1/Occludin）的结构完整性损伤。上述结果表明，ISO处理的微生物代谢物可通过调节P-gp和CB2蛋白表达来缓解LPS诱导的Caco-2细胞结构损伤和炎症反应，且可能与P-gp/eCB信号通路有关。

讨论

肠道屏障阻止肠道内的微生物、抗原和有毒大分子侵入机体，是机体抵御外界环境的第一道防线。肠上皮TJ是肠黏膜屏障的重要组成部分。在生理条件下，肠道内大量微生物与IECs相互作用维持动态平衡，一旦TJ减少或缺失，细胞间隙通透性增加，细菌和各种大分子物质可通过TJ进入循环，引发疾病，包括坏死性小肠结肠炎（NEC）、IBD、乳糜泻、糖尿病、HIV相关性腹泻、食物过敏等。Caco-2细胞培养形成的IEC单层屏障模拟了体外肠道屏障，是用于免疫相关研究或分析（如肠道炎症、黏膜防御和对固有菌群的免疫耐受）的成熟体外肠道模型。

LPS，又称内毒素，是一种主要的细菌病原体，其与IECs直接接触会破坏细胞间TJ蛋白，从而破坏TJ结构，导致肠道通透性增加。当TJ受损或变得可渗透时，LPS和其他管腔抗原可通过旁细胞途径突破屏障，导致肠道炎症的发生。持续的炎症刺激可加剧肠道屏障损伤，导致功能进一步障碍和促炎细胞因子产生增加。研究表明，IBD患者循环LPS水平升高；类似地，在IBD动物模型的肠道组织和血清中检测到高水平的LPS。因此，LPS水平升高会对IECs产生不利影响，导致肠道屏障完整性受损。本研究中，通过LPS暴露创建了Caco-2细胞损伤模型。结果显示，随着LPS浓度增加，Caco-2细胞活力显著下降，细胞凋亡更明显，ZO-1和Occludin蛋白水平逐渐降低。

早期研究表明，ISO显著减轻DSS诱导的结肠炎症，并通过调节肠道菌群及其代谢产物缓解小鼠溃疡性结肠炎。然而，ISO调节的微生物代谢物在损伤体条件下对IECs炎症反应的影响尚不清楚。CCK-8实验结果表明，ISO调节的微生物代谢物在10 mg/mL浓度下显著增加了LPS引起的细胞活力降低。ELISA和RT-qPCR检测ISO调节的微生物代谢物对LPS刺激的Caco-2细胞炎症反应的影响显示，ISO调节的微生物代谢物显著降低了LPS诱导的Caco-2细胞中促炎因子IL-6和TNF-α的表达。TJ蛋白在氧化应激或炎症状态下对于维持IE