高效稳健的新型峰检测工作流程在LC-MS肽图多属性方法中的开发、验证与应用

《mAbs》：Development, qualification, and application of a highly efficient and robust new peak detection workflow for the LC-MS peptide mapping multi-attribute method

本综述系统阐述了基于Genedata Expressionist?软件平台的新型峰检测（NPD）工作流程的开发、验证与应用。该工作流程通过理性设计的检测阈值（IT/FCD）、自动假阳性峰剔除策略及已知峰列表（KPL）的应用，实现了对生物药（如单克隆抗体）中低于1%相对丰度的相关肽段的可靠检测，且无假阳性峰报告。其成功验证（遵循ICH Q2指南）及案例研究（制剂稳定性测试、原料药未知杂质检测）表明，该NPD工作流程显著推动了多属性方法（MAM）作为质量控制工具的应用进程。

　　

引言

蛋白质生物制药，如单克隆抗体（mAbs），在多种重大疾病的治疗中扮演着关键角色，其全球销售额在2021年已超过3000亿美元。在生物药开发过程中，可能影响生物活性、药代动力学/药效学（PK/PD）、免疫原性或安全性的产品相关变异体，通常通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）肽图分析进行表征。这些关键质量属性（CQAs）在受监管的GMP环境下，通过设定适当的工艺参数范围、进行过程中控制以及放行和稳定性测试来进行监控。由于蛋白质生物制药的结构复杂性和异质性，通常需要多种正交的基于液相色谱（LC）和毛细管电泳（CE）的方法来全面评估被视为CQAs的产品相关变异体。然而，证明这些方法作为纯度/杂质检测方法的适用性，需要对单个峰进行表征，这既耗时又往往显示出这些方法在区分与安全性和有效性相关及不相关的产品相关变异体方面的能力有限。

近年来，使用基于LC-MS肽图分析的多属性方法（MAM）作为质量控制工具受到越来越多的关注，因为它提供了替代多种传统HPLC和CE-based纯度/杂质检测方法的可能性，同时提供了改进的特异性来监控和相对定量单个产品相关变异体。MAM包含两个功能，这两个功能都是其作为纯度检测方法应用所必需的。首先，通过靶向监控质量属性，利用MAM肽库中记录的相应未修饰和修饰肽段的质量和保留时间（RT）信息，对先前已表征的蛋白质修饰进行相对定量。其次，新峰检测（NPD）功能涉及将样品与充分表征的、产品特异性的参考标准品进行比较，以识别新的、缺失的和发生变化的特征。NPD功能被认为是MAM技术的关键要素，用于检测可能由于药物原料（DS）或制剂（DP）生产和储存过程中的偏差而出现的任何先前未知的蛋白质修饰或变化特征。对于NPD的稳健性能而言，可靠地区分真阳性峰和假阳性峰，并实现足够的灵敏度以检测可能损害药物安全性或有效性的物质（即避免假阴性峰）至关重要。因此，一个稳健且灵敏的NPD工作流程是用MAM替代多种传统方法同时降低对企业和患者风险的基本要求。

由于LC-MS实验中分析物通过保留时间和质量进行二维分离，产生的MS数据集比传统的LC或CE-based方法复杂得多，可能包含超过10,000个潜在的肽信号。因此，人们提出了几种缓解策略来减少假阳性峰的数量，同时保留所有真阳性峰用于NPD。随机信号波动通过参考和样品重复策略或更复杂的统计方法来避免重复进样来解决。此外，将不考虑报告的信号收集到已知峰列表（KPL）中，或定义适当的系统适用性测试（SST）标准已被证明是成功的。

已经提出了几种NPD数据分析工作流程来揭示新峰，例如在克隆选择或通过LC-MS/MS进行表征过程中出现的意外序列变异。2017年，Griaud等人应用了跨多个样品的所有肽图信号的差异分析，揭示了仅在预期的生物类似药批次中一致存在的序列变异（范围在0.5-7.2%），而在原研药样品中不存在。该MS工作流程具有足够的灵敏度来揭示相关的序列变异，而传统方法缺乏所需的分辨率和灵敏度。2023年，Niu等人发布了一个NPD工作流程，用于揭示在生物工艺样品中检测到的序列变异，性能相当（范围在0.8-38.7%）。Cao等人能够可靠地检测到与另一种以2%相对丰度掺入样品中的mAb相关的新峰，在大多数（23次中的20次）实验中没有假阳性峰。如果预期来自掺入蛋白的信号在肽库中预先定义或工作流程针对特定样品集进行了优化，甚至可以实现低至0.5%（mAb）或0.01%（宿主细胞蛋白）的检测阈值。

除了这些策略之外，提高检测阈值，如强度阈值（IT）和倍变化检测（FCD）阈值，已被证明可以显著减少假阳性峰的数量，但代价是灵敏度降低。IT通常表示为相对于最强信号基峰色谱图（BPC）或总离子流色谱图（TIC）的百分比。据报道，IT值范围在0.10?1.0% BPC和0.01?1.0% TIC。最小FCD阈值基于同一样品多次进样的固有信号变异性确定，通常设置在5到10倍的范围，尽管在低于2倍的FCD阈值下也显示出零假阳性的足够性能。阈值大多是凭经验定义的，只有有限数量的关于阈值定义的策略和理论考虑被发表。其他相关的NPD参数是质量和保留时间容差窗口，通常分别定义为5至20 ppm和0.2至0.8分钟。为了排除非肽类物质，只考虑电荷大于一且具有多于一个同位素的信号。NPD工作流程的性能通过计算检测限和定量限或确定mAb酶解产物中加入重同位素标记合成肽的假阳性和假阴性数量来评估。在优化条件下，所有15种掺入的肽段在低至相对于半抗体0.2%的掺入水平下都能被准确检测，且没有任何假阳性信号。

本文描述了使用MS软件Genedata Expressionist开发NPD工作流程，该工作流程结合了多种策略，以卓越的灵敏度检测真阳性新峰，同时避免检测假阳性峰。所提出的NPD方法将先前发表的减少假阳性的概念整合到一个单一的、高度自动化的工作流程中，并在一个商业化的、与MS仪器供应商无关的数据分析软件中解决了分析速度、稳健性、用户友好性以及数据可视化和解释工具方面的关键需求。减少假阳性峰数量的活动和策略辅以新开发的自动假象检测功能，这些功能有助于消除由仪器噪声、聚合物物质和源内加合物形成引起的假阳性。在根据ICH Q2指南进行验证之前，提出了定义检测阈值的策略和考虑因素。最后，证明了经过验证的工作流程在蛋白质生物制药药物放行和稳定性测试以及可靠检测未知杂质方面的适用性。

结果

开发用于稳健检测真阳性新峰的集成MAM工作流程

开发并依次应用了几个NPD工作流程活动，以可靠地区分相关峰（即源自产品及其变异体的峰）与所有其他被视为不相关的峰（如果在数据分析过程中未被移除，将转化为假阳性峰的报告）。真阳性峰可能源自产品的未修饰/修饰肽段或工艺相关杂质（如宿主细胞蛋白），而假阳性峰可能源自DS/DP基质（如辅料），也可能是仪器噪声、样品制备问题、肽段源内降解或金属加合物形成的结果。为了解决化学噪声、加合物形成和聚合物辅料（例如聚山梨酯）的存在（这些是假阳性峰的常见来源），开发了一种自动假象检测能力，该能力利用这些物质在LC-MS实验中的已知行为进行识别。

为了在质量控制（QC）环境中应用MAM，并利用产品表征的先验知识进行新峰检测，新开发的NPD功能被集成到Genedata Expressionist软件中现有的靶向属性监控工作流程中（数据未显示）。在产品开发过程中，MAM肽库预计会不断演变，并理想地包含在放行和稳定性期间观察到的、高于一定丰度阈值的所有产品相关变异体的肽段，最迟在工艺性能确认（PPQ）时完成。考虑到这些产品相关变异体已就其对产品质量、安全性和有效性的影响进行了表征，它们不应被报告为新峰。如果认为对产品的整体控制策略相关，这些属性的相对丰度可以在放行和稳定性测试中根据预定义的限制进行测试，或用于验证工艺一致性。

在应用NPD之前，创建了产品特异性的MAM肽库和KPL。MAM肽库是通过分析经受热、氧化、糖化、pH和光照应激条件的mAb1样品，在LC-MS/MS肽图分析实验中构建的。通过MS鉴定出mAb1相关的未修饰和修饰肽段，并通过MS/MS确认其氨基酸序列，然后记录其质量、最丰富电荷态和保留时间信息。最终，得到的MAM肽库包含172个条目，共计28个未修饰的mAb1肽段和125个独特的降解产物或翻译后修饰肽段，如脱酰胺、异构化、氧化、剪切、糖化和糖基化物种。对于选定的修饰（例如N-糖基化），在MAM肽库中记录了多个电荷态的质量和RT信息。

通过使用上述NPD工作流程，将产品特异性参考标准品（定义为样品）的重复进样与同一标准品（定义为参考）进行比较，构建了KPL。IT设置得比NPD常规性能预期略低，以考虑强度波动并捕获所有相关物种。由于样品和参考是相同的，可以假设NPD工作流程检测到的所有新峰都是假阳性峰，因此将相应的峰与其m/z、电荷态和保留时间信息记录在KPL中。在经过两套可比LC-MS设置对产品特异性参考标准品的九个独立制备物进行四轮LC-MS分析后，未发现新峰，表明KPL包含了最常观察到的假象。最终，mAb1的KPL包含40个独特条目，共计28个烷基化不足的肽段物种、3个多聚气相复合物和9个未知来源的低强度污染物，这些污染物表现出接近定义强度阈值的任意强度波动。虽然烷基化不足的肽段作为新物种和变化物种的报告可能通过微调样品制备过程中的烷基化条件来解决一定程度的问题，但多聚气相复合物是在电喷雾电离过程中形成的，因此代表了技术固有的假象。作为预防措施，低强度污染物被包含在mAb1 KPL中，尽管相应的信号可能通过统计评估和样品重复评估在NPD分析中被有效识别为假阳性。尽管该KPL在我们的研究范围内用于常规测试，但应注意开发的NPD工作流程允许添加在产品开发过程中可能观察到的其他物种。

选择检测阈值以确保稳健且灵敏的NPD性能

选择适当的检测阈值（即IT和FCD阈值）对于NPD工作流程的稳健性能至关重要。IT越低，NPD工作流程需要评估的信号就越多，从而增加报告假阳性的风险。另一方面，非常高的IT可能导致产品相关肽段上的低丰度修饰无法检测。

考虑到产品相关变异体对质量、安全性和有效性的潜在影响，任意选择了0.9%的报告水平（RL）。随后，基于产品相关肽段的MS强度分布定义IT，以确保对于MAM肽库中包含的所有28个未修饰的、主要的mAb1肽段，超过95%的肽段其修饰在RL以上可被检测。以相对强度表示，IT设定为BPC的0.05%或主要肽段中位强度的0.13%。

最小FCD阈值是基于单个LC-MS序列内观察到的MS强度固有变异来估计的。该变异表示为产品特异性参考标准品个别制备物重复进样所获得的产品相关肽段的MS强度倍变化。对于每个肽段和每次进样，通过考虑所有进样中观察到的最低强度作为分母来计算最坏情况下的倍变化。最后，计算同一分析序列内10次进样的倍变化的平均值和标准差（SD）。考虑到MAM肽库中所有产品相关肽段，计算出的最坏情况倍变化（平均值+3 SD）在1.1到2.0的范围内。mAb1进一步NPD分析的最小FCD阈值被设定为超过可变性最大的肽段的最坏情况倍变化，并定义为3.0。

NPD工作流程和分析控制策略的验证

RL、IT和FCD阈值通过将合成肽段（即Pierce?保留时间校准（PRTC）标准品）掺入mAb1酶解产物中进行确认，类似于其他人描述的方法。等摩尔的PRTC校准混合物包含15种重同位素标记的肽段，具有不同的疏水性，覆盖了LC方法的保留时间范围，因此被认为代表了NPD工作流程在常规使用中应检测的潜在新物种。由于MAM NPD工作流程被视为限度测试，因此根据ICH Q2指南验证了特异性以及检测限和定量限（DL/QL）。

特异性通过无干扰证明。使用上述NPD工作流程和KPL，将五份mAb1（定义为样品）的重复进样与同一分析序列中的另一份mAb1酶解产物（定义为参考）进行比较。在五次重复进样中均未检测到新峰，证实了特异性，表明无基质组分、杂质和产品相关肽段物种的干扰。

为了验证DL和QL，将PRTC肽段以0.1、0.3、0.4、0.5和1.0 pmol的水平掺入mAb1酶解产物中。考虑到上样量为4 μg mAb1（即约相当于56 pmol的轻链和重链肽段），所选PRTC掺入量转化为相对于产品相关肽段物种的0.2%、0.5%、0.7%、0.9%和1.8%相对丰度。每个掺入水平进样六次，并将得到的PRTC肽段的MS强度对pmol为单位的掺入水平作图。对于15个肽段中的每一个，在整个测试范围内观察到线性响应（R² ≥0.99）。DL和QL基于回归线的斜率和y截距的标准误差计算。考虑到所有15个PRTC肽段，DL估计在0.013–0.032 pmol范围内（即约相当于0.02–0.06%相对丰度）。相应地，QL在0.040–0.097 pmol范围内（即约相当于0.07–0.18%相对丰度）。由于确定的DL和QL低于定义的IT和RL，可以假设存在于RL以上的产品相关变异体可以被可靠地检测和定量。因此，IT和RL都被认为是合格的。这通过六次重复进样mAb1酶解产物（掺入RL水平的PRTC肽段，即0.5 pmol掺入量对应0.9%相对丰度）并使用未掺入的mAb1酶解产物作为参考进行NPD得到证实。在每次重复进样中，所有15个PRTC肽段都被一致检测到，且未引入假阳性。然而，在最高测试掺入水平下，报告了两个假阳性峰。这些额外的峰包括PRTC 10的钠加合物以及涉及PRTC 7和mAb1肽段的异源二聚体。由于母体特征的错误同位素聚类，钠加合物在自动假象检测期间未被标记。手动编辑相应的PRTC 10同位素簇导致在相应的假象检测活动中正确标记了金属加合物。在本研究中，无法在工作流程层面防止基于PRTC 7的异源二聚体的报告。当前的NPD工作流程不允许系统性地标记人工气相复合物。然而，通过将已识别和确认的异源二聚体物种记录在项目特异性KPL中，可以显著降低在未来mAb1 NPD分析中重复报告此假象的风险。

使用用于确认IT的相同数据集评估倍变化检测的性能。掺入0.1 pmol PRTC肽段的mAb1酶解产物被定义为参考，而0.3、0.4、0.5和1.0 pmol的其他掺入水平被用作样品。根据实验设计，每个样品预计具有15个增加的PRTC相关肽段物种，其存在倍变化比率分别约为3、4、5和10，取决于掺入水平。相应地，NPD分析揭示了每个测量的mAb1样品和掺入水平下所有PRTC相关物种的预期增加。六次重复进样计算出的平均倍变化比率与预期值基本吻合，但PRTC 7除外，其获得了显著更高的倍变化比率。PRTC 7肽段异常倍变化比率的根本原因被发现与参考文件的数据预处理有关。即PRTC 7肽段几乎与一个具有同量异位素质量的mAb1物种共洗脱。这些同量异位素信号可能对数据预处理结果产生负面影响，导致在0.1 pmol掺入水平下略微低估了PRTC 7的强度。因此，参考信号强度的微小绝对变化转化为PRTC 7计算倍变化比率的显著差异。鉴于所有其他PRTC肽段的倍变化检测具有可接受的准确度（回收率，在103%至146%范围内）和精密度（%CV ≤ 25%），3倍或更高的FCD阈值被认为是合格的。

最后，通过在常规使用中结合阴性对照和阳性对照执行NPD工作流程来进行SST，以确认足够的特异性和灵敏度。产品特异性参考标准品的 bracketing 进样比较作为阴性对照，而参考标准品与掺入RL水平（0.5 pmol掺入量）PRTC肽段的同一参考标准品的比较作为阳性对照。

下面总结了为常规使用理性设计、验证和确认NPD相关检测阈值的整体方法：

1. 1.
   基于产品相关肽段的强度分布、期望的RL和肽段覆盖率定义初步IT。基于产品相关肽段的强度变异估计最小FCD阈值。
2. 2.
   使用PRTC肽段在略高于、等于和低于RL的水平掺入产品酶解产物中进行线性实验。
3. 3.
   基于线性数据计算PRTC肽段的DL/QL。证明DL低于IT和RL。证明在RL下所有15个PRTC肽段的可重复回收率。
4. 4.
   使用最低掺入水平作为参考，强度高于IT的其他掺入水平作为样品计算倍变化。证明确定的倍变化比率的足够回收率和精密度。
5. 5.
   基于在合格RL下PRTC掺入回收率设定SST，用于持续的方法性能确认。

NPD应用案例

通过两个相关应用案例证明了经过验证的NPD工作流程的效率和稳健性，这些案例的选择旨在展示其在QC环境中的性能。

应用案例1 – 稳定性测试

在此案例中，对mAb1 DP稳定性样品进行了MAM靶向属性监控和NPD分析。选择了在长期（24和36个月，2–8°C）和加速（3、6和24个月，25°C）条件下储存的样品，并进行了三次重复分析。IT和FCD阈值分别设置为BPC的0.05%和3倍。此外，使用了如上所述建立的KPL。靶向属性监控显示，在2–8°C下储存长达36个月后，产品质量属性如N末端焦谷氨酸、天冬酰胺脱酰胺、异天冬氨酸形成以及甲硫氨酸和色氨酸氧化仅略有增加，表明产品在预期的长期储存条件下是稳定的。相反，在25°C下长时间储存后，上述质量属性的相对丰度显著增加，并触发了额外的降解途径，如FA2聚糖结构的脱乙酰化。其他属性如高甘露糖物种在两种条件下均保持稳定，符合预期。与靶向属性监控的结果一致，NPD显示在长期条件下储存的样品中没有新的或变化的峰，而在25°C下储存3个月后即检测到变化的峰，并且变化的峰数量随着储存时间的增加而增加。

开发的自动假象检测、统计、基于KPL的已知物种注释以及IT和FCD阈值设定的结合使用，被观察到有助于有效过滤真阳性峰。不应用KPL时，在个别进样中检测到多达九个假阳性峰（全部与烷基化不足相关）。通过利用KPL信息，在所有15次进样中假阳性峰的数量减少到零。不需要考虑重复来进一步减少假阳性峰的数量（例如，由于任何重复进样中随机出现新峰）。另一方面，真阳性峰的数量不受使用KPL的影响。

此示例整体上突出了开发的MAM工作流程在监控多个个体产品质量属性（在位点特异性水平）以及通过NPD检测产品质量重大变化方面的效率。未检测到可能导致调查甚至不必要批次拒绝的假阳性。

应用案例2 - 杂质检测

在此案例中，测试了NPD工作流程在验证的RL处甚至低于RL检测未知杂质的能力。因此，将mAb1 DS用另一种IgG2抗体（mAb2）在低于和略高于验证RL的水平（即0.1%、0.5%、1.0%和2.0%（mol/mol））进行掺入。将混合物进行MAM样品制备程序三次重复，并通过LC-MS分析。对于NPD，将mAb1/mAb2酶解产物视为样品，而使用未添加mAb2的mAb1酶解产物作为参考。考虑到mAb1和mAb2属于相同的IgG同种型，但分别带有lambda和kappa轻链，预计最多有16个轻链肽段和最多10个重链肽段源自mAb2作为新峰。排除了预计在RP柱空体积洗脱的非常小和/或亲水的肽段。

使用已建立的KPL、mAb1特异性MAM肽库以及上述验证的IT阈值和FCD设置（即IT为0.05% BPC，FCD阈值为3倍）执行NPD工作流程。每个掺入水平的样品针对定义的参考进行独立分析。结果总结在表3中。在所有掺入水平，包括最低水平0.1%，mAb2特异性肽段被可靠地识别为新峰，且无需预先了解其身份。在所有掺入水平下均未识别出假阳性信号。该数据集中变化和新特征的总数为60个，4个物种基于电荷态特征被排除，29个被认为是真阳性，6个烷基化不足的肽段被KPL注释，21个物种被新开发的假象检测功能标记为加合物。

此外，在最高掺入水平2.0%时，额外检测到两个修饰的mAb2轻链肽段和一个重链肽段。虽然重链肽段被指定为携带多个漏切点的物种，但两个轻链肽段对应于完全酶切的肽段和相应的携带异天冬氨酸（而非预期天冬氨酸残基）的漏切肽段。基于未修饰和修饰肽段的MS强度，估计mAb2轻链中异天冬氨酸修饰的相对丰度约为12.5%，这与在本研究之外使用另一套LC-MS设置独立进行的mAb2 DS表征中确定的水平（11.8%）非常吻合。

总体而言，结果证实了NPD工作流程在低至0.1%相对丰度水平可靠检测未知杂质的特异性和灵敏度。此外，该数据集很好地证明了将包括NPD在内的MAM用作DS放行的身份测试的机会，因为可以一致地检测到在患者相关水平上mAb1 DS意外污染mAb2 DS的情况。

讨论

本文总结了使用商业化的MS软件Genedata Expressionist开发、确认和应用MAM NPD工作流程。新开发的NPD工作流程结合了先前描述的、独立的减少假阳性峰数量的策略，例如强度和倍变化阈值设定、考虑样品或参考重复、应用KPL和肽库以及使用统计方法。它还利用创新的自动识别和移除已知假象（包括仪器噪声、聚合物物种和源内假象）来提高效率。据我们所知，这种假象移除策略先前未被描述过。原则上，多个NPD工作流程活动可以处理同一个假阳性峰。因此，高度的内置冗余提供了一个非常稳健和可靠的工作流程，用于在没有任何假阳性峰的情况下检测真阳性峰。此外，开发的NPD工作流程允许在单个NPD分析中有效评估多个平行样品。在应用案例1中，并行分析18个样品的总分析运行时间约为20秒，而其他软件解决方案依赖于计算成本高且耗时的成对比较。当考虑到操作员审查自动化工作流程所做NPD分配所需的时间时，在最多约20个样品中检测、审查和报告新峰的总时间在30分钟以下。这种方法解决了分析时间的问题，该问题已被确定为当前NPD工作流程的一个限制。

由于NPD与靶向属性监控的结合使用未来可能取代QC实验室中的多种传统纯度/杂质方法，检测阈值应解决对患者的潜在风险，即存在任何新引入的、达到相关水平的杂质。因此，我们理性地选择了IT，考虑了产品相关肽段的MS强度分布和0.9%的RL。以相对强度表示，本研究中使用的IT定义为BPC的0.05%，这处于其他已发表NPD工作流程报告的灵敏度范围的低端。RL定义了产品相关变异体将被检测并报告为新峰的最低相对丰度。由于产品相关肽段的不同电离效率，对于给定的IT，低强度肽段上修饰的有效RL将高于最强度肽段。在以前的出版物中，IT仅基于最强信号（BPC或TIC）定义，这没有考虑产品相关肽段的不同电离效率，因此不允许评估对患者的风险。相反，本文提出的IT选择提供了一种基于风险的方法，可能支持将NPD作为纯度检测方法替代传统方法的合理性。因此，回应了Rogstad等人的要求，即“MAM的能力和性能应特别在候选蛋白质产品的CQAs及其整体控制策略的背景下进行评估。” 无论这些考虑如何，所提出的NPD工作流程旨在检测和识别任何存在的意外肽段或分子物种，无论它们是预期肽段的修饰、非产品相关杂质或污染物，如验证实验和应用案例2所示。

在将NPD工作流程完全验证用于商业放行和稳定性测试之前，预计NPD将在开发实验室中使用，这些实验室可能应用不同的LC-MS仪器。因此，IT必须定义为相对强度，以考虑不同质谱仪产生的绝对强度值的差异。商业QC实验室中使用的LC-MS仪器的足够灵敏度将通过确定DL来确认，该DL需要低于设定的RL和由此产生的IT，如上所述。然而，在开发过程中可能会应用较低的IT，以识别可能被表征并随后记录在KPL或MAM肽库中以保存知识的新峰。

FCD阈值设定为3倍，考虑了MS信号的固有变异性。尽管通过使用统计方法可以在不增加假阳性信号风险的情况下设定较低的FCD阈值，但与IT相比，FCD阈值在患者风险方面被认为不那么关键。与IT不同（IT是检测相关水平新峰的关键），FCD阈值将仅处理变化的信号，即存在于产品特异性参考标准品中的物种，因此已经暴露给患者。如果这些物种中的任何一个被认为对确保药物的质量、安全性和/或有效性高度关键，申办者可以决定将其纳入MAM肽库，并对其进行靶向监控，应用患者相关的限度。

RL、IT和FCD阈值已经过确认，并且整个工作流程已根据ICH Q2指南作为限度测试进行验证，方法是将DS与市售的重同位素标记肽段进行掺入。确定的DL和QL远低于预定义的RL，并且与其他人使用类似实验设计和LC-MS设置发表的结果非常一致。SST和接受标准已定义并使用经过验证的工作流程进行确认，以确保方法在整个生命周期内具有适当的灵敏度和选择性，符合ICH Q14原则。因此，RL的定义首次允许评估方法验证期间确定的检测限的充分性，并为持续方法性能确认证明系统适用性测试标准的合理性。

完全验证的工作流程的性能已通过考虑两个应用案例得到证明，这些案例是基于MAM在QC实验室中的潜在应用而设计的。第一个应用案例证明了MAM靶向属性监控以及NPD的稳定性指示能力，而第二个应用案例展示了NPD工作流程可靠检测可能污染产品的未知杂质的能力。在这两个应用案例中，在没有任何假阴性峰的情况下识别出了相关的新峰。大多数（> 99.9%）非相关峰可以通过自动假象检测、以产品为中心的IT和FCD阈值设定以及统计评估来排除。在此背景下应注意，在应用案例2中，新开发的自动假象检测能力对于将假阳性数量减少到零至关重要。没有自动假象检测，总共21个加合物将通过阈值设定、统计和重复评估标准，因此假阳性峰的数量将显著增加。新物种的加合物表现出与真阳性物种相似的特征，因此不能通过阈值设定、统计和/或重复评估