VHH单链抗体的免疫原性研究：胚系化降低FR2和CDR区T细胞表位激活

《mAbs》：Immunogenicity of single-chain antibodies: germlining of a VHH lowers T-cell activation from epitopes in FR2 and CDR regions

本综述深入探讨了骆驼源单链抗体（scAbs，即纳米抗体）的免疫原性挑战。研究聚焦于靶向SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的VHH76及其人源化、胚系化变体，通过灵敏的T细胞实验证明，健康供体血液中存在针对VHH76变体的特异性T细胞，而胚系化（Germlining）能显著降低T细胞应答频率。研究成功定位了T细胞表位，发现其分布于互补决定区（CDR1-CDR2）和CDR3区域。文章指出，尽管纳米抗体因其小分子量和高序列同源性被认为免疫原性较低，但临床观察到的抗药物抗体（ADA）反应表明仍需优化策略。该研究为理解VHH免疫原性提供了关键见解，并为降低治疗性纳米抗体的免疫风险提供了新思路。

　　

ABSTRACT

单链抗体（scAbs）源自骆驼科动物的抗体，因其分子量小和被认为免疫原性低而作为治疗候选分子受到关注。然而，近期研究报道了对几种scAbs的免疫反应。为了更好地理解其免疫原性，我们研究了由VHH76（一种靶向SARS-CoV-2 RBD的工程化VHH-Fc）及其人源化和胚系化变体诱导的T细胞反应。人源化变体包含六个人源氨基酸替换，而胚系化变体则是通过筛选VHH76序列的组合库获得的，该库在12个不同位点包含人源和野生型替换。最终，胚系化变体包含16个人源替换。所有VHH76变体均能引发健康供体的CD4⁺ T细胞反应，但胚系化VHH76显示出显著降低的T细胞刺激。研究确定了两个表位区域：一个与CDR3重叠，另一个从CDR1延伸至CDR2。在FR2中VHH保守位点进行额外的人源替换，会损害胚系化VHH76的生物学特性，并且似乎未能明显降低T细胞反应的风险。总之，通过使用灵敏的T细胞测定法，我们证明了在健康供体血液中检测到了针对VHH76变体的特异性T细胞，并且响应T细胞的频率随着胚系化而降低。虽然CDR3中的表位与VHH76的特异性相关，但修改保守的FR2区域对降低VHH76免疫原性提出了挑战。这项研究有助于理解VHH76的免疫原性，并为减轻免疫反应的策略提供了见解。

Introduction

单链抗体（VHH），最初源自骆驼、羊驼等骆驼科动物中天然存在的仅重链抗体，其可变域（VHH）由单个单体可变域组成，保留了完整的抗原结合能力。这种独特的结构不仅简化了其生产，还可能增强其组织穿透性，而其长的CDR3被认为有助于识别常规抗体无法接近的表位。此外，VHH是模块化蛋白质，可以轻松地与其他VHH或不同蛋白质（如Fc区域或全长抗体）组合，以创建具有短或长半衰期的多价或多特异性蛋白质。得益于其模块化，这些VHH衍生蛋白（单链抗体或纳米抗体）实现了广泛的域组合，从而产生了众多的创新治疗候选分子。虽然已有几种纳米抗体被批准用于治疗炎症性疾病和罕见血液疾病，但还有许多其他纳米抗体正在肿瘤学、自身免疫病和传染病等广泛治疗领域中被积极探索。例如，纳米抗体已被开发为针对HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒等病原体的中和剂。在COVID-19大流行期间，靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体被迅速开发出来，并在中和病毒方面显示出潜力，突显了其在应对新发传染病方面的多功能性和实用性。

纳米抗体在治疗应用中的另一个吸引人之处在于其被认为较低的免疫原性，特别是因为首个获批的VHH衍生分子卡普拉珠单抗（Cablivi?）引发的抗药物抗体（ADA）反应很少。低免疫原性对于开发安全有效的生物疗法至关重要，因为针对治疗性蛋白质的ADA形成可能导致疗效降低、不良反应和治疗失败。纳米抗体假定低免疫原性归因于其小分子量、与人类免疫球蛋白的高序列同源性以及缺乏Fc区域。然而，几项研究在治疗患者的血液中检测到了针对纳米抗体的ADA。ADA可能在基线时即存在，即在任何纳米抗体暴露之前可检测到的预先存在的抗体，但其起源仍不确定。为了减轻这种反应性，已有工程策略被提出以消除天然抗体的结合。除了基线血清反应性外，治疗期间也记录到了新发的中和性或非中和性ADA的出现。高达36%的患者对恩沃利单抗（ENWEIDA，恩維達?）（一种VHH-Fc融合蛋白）产生了ADA，而奥托利珠单抗（Nanozora?）（一种三价抗TNFα纳米抗体）在临床试验中超过40%的患者出现了ADA。尽管经过了人源化，纳米抗体仍能引发ADA反应，这强调了需要更先进的策略来增强这些治疗产品的安全性。

生物药物的免疫原性受多种因素影响，包括与药物本身相关的内在因素，以及源于患者遗传背景、疾病状态、免疫状况和给药方式的外部因素。免疫原性的一个关键驱动因素是生物药物序列中存在CD4⁺ T细胞表位。CD4⁺ T细胞表位是特定的肽片段，由生物药物的蛋白水解降解产生，并由抗原呈递细胞（APCs）表面的HLA II类分子呈递以供T细胞识别。HLA分子的多态性在全球人群中非常显著，并极大地影响了它们的肽结合位点。因此，CD4⁺ T细胞表位的免疫原性不同，并且根据患者的HLA类型而异。在常规治疗性抗体中，CD4⁺ T细胞表位通常位于与胚系序列相比发生突变的区域内，因此通常与互补决定区（CDRs）重叠。由于CDRs对抗原识别至关重要，在不影响抗体功效的情况下修改这些区域以降低免疫原性具有挑战性。尽管VHH比常规抗体小，但其非人源成分仍可能含有引发不必要免疫反应的T细胞表位。VHH的T细胞反应性研究甚少，但识别CD4⁺ T细胞表位可能有助于减少ADA形成并改善VHH基治疗药物的整体安全性。

在本研究中，我们研究了对VHH-Fc（VHH76）的T细胞反应。VHH76源自对SARS-CoV-1受体结合域（RBD）特异的VHH72。通过深度突变工程，VHH76被改造以提高其对SARS-CoV-1和SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力，使其能够有效中和多种病毒变体。研究人员生成了几种形式的VHH76以人源化其序列，并随后测试了它们引发从健康供体收集的细胞产生T细胞反应的能力。VHH76特异性T细胞系的生成使我们能够揭示骆驼源和人源化VHH76变体之间T细胞反应的不同水平，并识别CD4⁺ T细胞表位。

Materials and methods

Production and biotinylation of RBD SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 Delta病毒株RBD编码基因被克隆到pCAGGS RBD-SARS-CoV-2质粒中。通过瞬时转染HEK293 Freestyle?细胞，使用线性聚乙烯亚胺（PEI）进行转染。转染后培养7天，收集上清液，使用HisTrap Excel柱进行纯化，并进行尺寸排阻色谱（SEC）纯化。使用EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotin对SARS-CoV-2 RBD进行生物素化标记，并通过脱盐柱去除未反应的生物素。

Yeast surface display of VHH

使用EBY100酵母细胞，按照Benatuil等人的方法制备感受态细胞并进行文库转化。通过gap repair转化将文库克隆到pSWG VHH76质粒的NheI和NotI限制性位点之间。转化后，细胞在SD-CAA培养基中培养，然后转移到SG-CAA培养基中进行诱导表达。

Screening of VHH specific for RBD SARS-CoV-2 by cytometry

对诱导的酵母细胞文库进行分选。细胞用PBSF洗涤后，与适当浓度的生物素化RBD-Delta抗原在PBSF中孵育2小时。冰上洗涤后，用抗HA抗体（DyLight? 650标记）和链霉亲和素-PE进行染色。使用流式细胞仪（BD FACS Aria? III）进行分选，分选门基于共表达EGFP的亲本克隆（VHH 76H）的荧光信号设定。

Design of DMS or combinatorial libraries for YSD screening

构建了两个深度突变扫描（DMS）文库，覆盖VHH76H序列125个位点的所有20种可能单氨基酸突变（两个文库分别覆盖1-59和61-125位点）。此外，构建了一个组合胚系化突变库，通过在12个选定位点引入人源胚系或亲本骆驼源氨基酸，使用Mutation Maker设计引物，通过SOE-PCR生成包含1024种DNA变体的文库。

Deep sequencing and analysis of NGS data

提取各酵母群体的质粒DNA，进行两步PCR扩增目标区域并添加Illumina接头和条形码。使用Illumina ISeq 100进行深度测序。使用Galaxy平台处理测序数据：连接配对读数，修剪读数以保留正确阅读框内的目标区域，应用质量过滤器（最低质量分数30），将DNA序列翻译为蛋白质序列，分组相同序列并过滤掉重复次数少于两次的序列。使用RStudio计算每个单点突变的富集比率。

Production of VHH-Fc proteins

通过PCR介导的精确基因合成构建选定的VHH76-Fc表达质粒，并克隆到哺乳动物表达载体pCDNA 3.4中。通过瞬时转染Expi293F?细胞生产VHH-Fc蛋白。转染后培养，收集上清液，使用HiTrap Protein A柱进行纯化，并进行SEC纯化。

Affinity measurement by biolayer interferometry

使用Octet RED96仪器通过生物层干涉技术测定结合动力学。将VHH-Fc分子（50 nM）加载到Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors上60秒。基线平衡后，在不同浓度（50 nM至0.78 nM）的RBD SARS-CoV-2 Delta存在下测量结合300秒，然后在动力学缓冲液中解离1500秒。扣除无抗原对照的数据，并使用全局1:1 Langmuir结合模型拟合结合动力学曲线。

S-Fuse neutralization assay

使用S-Fuse中和试验评估VHH的中和活性。该试验利用U2OS-ACE2 GFP1–10或GFP11细胞（S-Fuse细胞）在被SARS-CoV-2（包括Delta变体）有效感染时发出绿色荧光蛋白（GFP）信号的原理。简要步骤如下：将细胞混合并铺板，将SARS-CoV-2 Delta病毒株与不同浓度的VHH在室温下孵育15分钟后加入S-Fuse细胞。18小时后固定细胞，用Hoechst染色，使用高内涵共聚焦显微镜（Opera Phenix）获取图像，并使用Harmony软件量化GFP面积和细胞核数量。根据重复测量计算中和百分比和ED50（50%中和浓度）值。

Thermal stability

使用Nanotemper的Promotheus NT48仪器评估热稳定性和聚集性。将1 mg/mL的VHH-Fc构建体装入高灵敏度毛细管中，以每分钟1°C的速率从20°C升温至95°C。通过计算荧光信号比（350 nm/330 nm）的导数并测量散射信号，分别确定Tm（解链温度）值和聚集温度值。同时计算相关的起始值。

Generation of specific T-cell lines

从匿名健康供者（已签署知情同意书）的全血中分离外周血单核细胞（PBMCs）。通过5天培养含有重组人（rh）IL-4和rhGM-CSF的AIM-V培养基，从 Percoll 梯度分离的细胞中产生单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDCs）。将iDCs（每孔20,000个）与1或3 μM的VHH或1 μM的钥孔戚血蓝蛋白（KLH）在含有LPS和R848的AIM-V培养基中于37°C过夜孵育进行负载。洗涤后，将负载抗原的iDCs与自体CD4⁺ T细胞（每孔200,000个，通过阳性磁珠分选获得）在含有IL-6和IL-12的完全IMDM培养基中共培养。在第7天和第14天，用新鲜负载相应蛋白质的自体iDCs对CD4⁺ T淋巴细胞进行再刺激，并在含有IL-2和IL-7的完全IMDM培养基中培养。CD4⁺ T细胞系（每个独立孔中的T细胞）的特异性在第21天（用于评估特异性T细胞频率）和第28天（用于T细胞表位作图，在第21天再刺激一次后）进行评估。

IFN-γ ELISPOT assay

使用多屏HA 96孔板，包被抗人IFN-γ单克隆抗体过夜。用完全IMDM培养基封闭2小时。将VHHs（3 μM）负载到自体iDCs上4小时，KLH使用浓度为2 μM。重叠肽直接以肽池或单个肽的形式加入MultiScreen板，终浓度为10 μg/mL。将PBMCs（50,000/孔）或蛋白质负载的iDCs（5,000/孔）作为APCs，与大约10,000至30,000个CD4⁺ T细胞在含有rh-IL-7的AIM-V中共培养过夜。洗涤后，依次加入生物素化抗人IFN-γ mAb、ExtraVidin-磷酸酶和NBT/BCIP底物进行显色。使用AID ELISPOT Reader System计数斑点数量。当存在蛋白质或肽时的斑点计数比不存在时高2倍，且最小差异为25个斑点时，认为该CD4⁺ T细胞系具有特异性。使用泊松分布公式估算CD4⁺ T细胞前体频率。

Results

Design of germlined VHH76 combinatorial library by using DMS

为了胚系化VHH76序列并在FR和CDR区域引入人源替换，研究人员首先将先前在亲本VHH72中引入的人源替换应用到VHH76中，创建了人源化的76H纳米抗体。随后，旨在识别76H序列中能够耐受人源替换而不影响其与SARS-CoV-2 RBD结合能力的许可位点。为此，采用了深度突变扫描（DMS）方法。由于测序读长限制，构建了两个全面的DMS文库，每个文库覆盖76H序列125个位点的所有20种可能单氨基酸替换。文库分为两部分：一部分覆盖氨基酸1-66，另一部分覆盖67-128。VHH变体通过Aga1p/Aga2p系统展示在酵母细胞表面，并通过HA-Tag监测表达。通过将酵母细胞与生物素化的RBD-Delta抗原孵育，然后进行流式细胞术分析来评估结合情况。为了准确比较突变克隆与亲本76H的RBD结合能力，研究人员共表达了一小部分（通常5-10%）含有亲本克隆和细胞内增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的细胞（使用附加质粒pSWG 76H EGFP）。这种方法可以在FACS分析中根据EGFP荧光信号（黑色）区分亲本克隆，从而精确定义分选门。流式分析显示，大量结合RBD-Delta能力降低的变体仍保持高水平的HA-tag表达，表明它们在酵母表面正确展示。对低结合变体进行测序，以确定与结合亲和力丧失相关的特定突变，结果以热图形式显示。许多靠近CDR2或在CDR2和CDR3内的突变与显著的结合丧失相关，但其他替换则被良好耐受。为了进一步提高76H序列的人源化程度，研究人员使用IMGT数据库将其与最接近的人源胚系基因（IGHV3-23×01和IGHJ4×01）进行比较，并选择了12个存在氨基酸差异的位点。随后构建了一个聚焦的组合文库，仅在这些位点进行变异，允许引入人源胚系或亲本残基，从而限制文库多样性，同时允许可能有害的人源替换发生回复突变。在此阶段的研究中，决定暂时保留VHH中FR2的标志性保守位点（42F, 49E, 50R, 52F）和CDR2中的两个替换。通过SOE-PCR生成了一个单一的组合文库。

Screening of germlined variants and selection of VHH 76G3

通过流式细胞术筛选组合文库，以鉴定在酵母细胞中表达后具有高亲和力的变体。在低浓度RBD下进行了一轮分选，以分离最佳的RBD结合剂。虽然许多克隆表现出降低的结合亲和力，但有几个显示出与76H纳米抗体相当的表观亲和力水平，并由于读长限制对两个不同区域进行了下一代测序（NGS）。评估了分选前后每个包含人源/骆驼源替换的测序读数的富集情况，以评估这些替换对RBD结合的影响。值得注意的是，在残基5至68之间，人源替换T68A显著富集，表明其增强了RBD结合亲和力。相比之下，其他替换要么未能改善结合，要么显示出不同程度的亲和力降低。因此，从每个区域中移除了不太有利的替换（I67Y, Y115F），以设计胚系化的76G3。

将三种VHH变体（76, 76H, 76G3）表达为VHH-Fc构建体。转染后，纯化VHH-Fc分子，使用分析型SEC和SDS-PAGE进行表征，并通过生物层干涉技术测量它们对RBD-Delta抗原的亲和力。所有变体对SARS-CoV-2 RBD都表现出强大的亚纳摩尔级亲和力，具有相似的结合常数。76和76H的亲和力常数分别为345 pM和21 pM，76H的解离速率比76慢。76G3变体的活性低于76H，但与76相似。所有三种变体对SARS-CoV-2 Delta病毒都表现出强大的中和活性，ED50值非常相似，均低于0.02 μg/mL。正如预期，使用OASis百分位数计算的序列人源化程度，76G3显著高于VHH 76、76H和卡普拉珠单抗，且76G3包含的非人源9肽更少。胚系化也适度减少了与HLA II类分子的结合核心数量，特别是对于对应于中等（10%）和低（20%）HLA II类分子结合亲和力的百分位数。最后，通过NanoDSF技术对三种VHH变体进行热稳定性测试，揭示了76G3的明显优势。76G3变体的变性温度（Tm）为65°C，而76和76H分别为52°C和58°C。所有变体在大约80°C时出现聚集。总之，76G3结合了亚纳摩尔级亲和力、针对SARS-CoV-2的有效中和活性、卓越的稳定性、改善的人源化程度和降低的T细胞表位预测。这提高了76G3具有较低免疫原性风险的可能性，因此可能比原始VHH76和部分人源化的76H更不易引发T细胞。

Evaluation of the T-cell response to VHH76

由于动物模型对人类免疫反应的预测性较差，研究人员使用了一种基于人类T细胞的测定法来评估VHH-Fc的免疫原性风险，该测定法依赖于在正常人类供体血液中检测特异性T细胞。这种方法的原理是，正常供体的T细胞库模拟了患者在输注VHH之前的T细胞库状态。由于健康供体中抗原特异性T细胞的频率很低，研究人员尝试通过生成T细胞系来检测VHH特异性T细胞。从健康供者收集的CD4⁺ T细胞在24个培养孔中经过3轮与负载VHHs或KLH（作为阳性对照）的DCs刺激进行培养。通过IFN-γ ELISPOT评估抗原特异性，通过在细胞培养开始时添加IL-12使T细胞偏向Th1表型。结果显示，来自同一供者的T细胞在24个接种培养孔中，分别有10、6和3个孔含有针对76、76H和G3的特异性T细胞。不同供者之间VHH特异性T细胞系的数量差异很大，反映了HLA多态性和初始T细胞库多样性的影响。随后，研究人员估算了每种VHH和KLH的抗原特异性CD4⁺ T细胞的平均频率，假设在测定开始时它们的分布遵循泊松分布。KLH为每位供者都产生了T细胞系，平均频率为每百万个CD4⁺ T细胞中有5.6个特异性细胞。对76和76H的T细胞反应非常相似，T细胞频率分别为每百万1个和0.93个。76G3的平均频率显著较低，为每百万0.4个细胞。因此，虽然VHH76的人源化并未降低免疫原性风险，但序列的胚系化降低了这种风险，因此似乎是有益的。

Identification of CD4 T-cell epitope of VHH76

研究人员随后旨在识别VHH76序列内的CD4⁺ T细胞表位，以全面了解其位置。如前所述，通过将纯化的CD4⁺ T细胞与负载VHH76的自体DCs共培养，从12名经过HLA分型的供者中生成CD4⁺ T细胞系。T细胞系首先使用肽池进行ELISPOT测定，并在第二次独立的ELISPOT中使用单个肽确认其特异性。总共有14个T细胞系被发现对单个肽有反应，并精确定位了总共11个T细胞表位。CD4⁺ T细胞表位聚集在两个不同的区域：一个是CDR3，它是由V、D和J基因重组产生的；另一个区域从CDR1延伸到CDR2。后一个区域因此包含了FR2区域，该区域含有在纳米抗体中保守但非人源的氨基酸。

Humanization of the FR2 region

研究人员随后聚焦于76G3的FR2区域，因为该区域包含许多T细胞表位，并且包含了在VHH中保守但与相应人源胚系序列不同的标志性残基。因此，该区域可能参与了不同VHH的ADA反应的发生。相比之下，CDR3区域对每个VHH是独特的。因此，研究人员在FR2中VHH的保守残基（即42、49、50和52位）引入了人源替换。其中两个替换提高了序列的人源化程度（通过OASis指数评估）。然而，这些替换对非人源9肽含量的改变很小，并且预测的HLA结合核心数量与76G3相比变化不大。将这3种VHH作为VHH-Fc生产、纯化，并表征了它们的亲和力和稳定性。替换44和45没有改变VHH的结合参数，略微提高了其变性温度，但改变了聚集曲线。其他替换更有害。替换37明显使VHH不稳定且活性降低，而替换47导致分子活性不高。因此，FR2位点的人源化并未降低免疫原性风险，同时未能保持完全的结合活性。

Discussion

本研究调查了针对VHH76（一种靶向SARS-CoV-2 RBD的纳米抗体）的T细胞反应，以预测其在人类中的免疫原性。结果表明，VHH76的胚系化降低了T细胞的启动，并揭示了两个含有VHH76特异性T细胞表位的区域。

从VHH76药物开发的角度出发，研究人员旨在尽可能广泛地人源化其序列。首先引入了先前在亲本抗体VHH72中被确定为耐受良好的人源替换，产生了人源化的76H变体。然后通过引入16个胚系替换进一步扩展人源化，产生了76G3变体。鉴于动物模型在预测人类免疫原性方面的局限性，研究人员使用了一种基于人类的T细胞测定法来评估这三种VHH76变体（76、76H和76G3）的特异性T细胞反应。所有三种VHH变体均在多位供者中引发了体外T细胞反应。76和76H的特异性T细胞频率相当，但胚系化形式76G3的频率显著降低。值得注意的是，所有VHH变体观察到的反应范围与已知的免疫原性抗体（如阿达木单抗和依奇珠单抗）相似，表明存在潜在的免疫原性风险，尽管胚系化的76G3风险较低。这一结果与另一项调查VHH体外T细胞反应的研究发现形成对比。几个差异可能解释了这种不一致，包括T细胞测定方法、VHH序列和分子形式。所检查的VHH至少在CDR3上有所不同，而在本研究中，CDR3含有VHH76独特的CD4⁺ T细胞表位。此外，本研究的构建体是VHH-Fc融合蛋白，而非单域VHH分子。VHH-Fc构建体中的Fc区域可能通过Fcγ受体（FcγR）或新生儿Fc受体（FcRn）增强树突状细胞（DCs）的摄取，从而改善向T细胞的表位呈递。

根据实验，VHH76变体似乎存在免疫原性风险，包括已胚系化的76G3。正如最近报道的，对于一些纳米抗体，VHH人源化策略可能不足以预防新发ADA的出现。恩沃利单抗是一种与VHH 76、76H和76G3类似的含Fc构建体，在高达36%的患者中具有免疫原性。恩沃利单抗与PD-L1结合，而PD-L1在DCs上表达，这可能促进恩沃利单抗肽段向T细胞的呈递。缺乏Fc的多价纳米抗体，如沃巴利珠单抗、索奈利珠单抗和奥托利珠单抗，也显示出显著的ADA反应。相比之下，卡普拉珠单抗和格夫鲁利单抗似乎免疫原性较弱。这些观察结果强调了在有限的已研究VHH中存在的早期异质性，并且随着临床经验的积累，它们的免疫原性最终可能像全长抗体一样多变。免疫原性是多种因素作用的结果，这些因素取决于患者（遗传、疾病、合并用药）、剂量和给药方式以及产品本身。由于这种多因素性质，仅凭T细胞测定无法完全预测临床环境中ADA反应的发生。然而，通过评估免疫原性风险，它们是对治疗候选分子进行排序的有价值工具，前提是它们足够灵敏以检测低频率的初始T细胞。

在本研究中，还识别了VHH76序列内的多个T细胞表位。应答供者产生了一到三个不同的T细胞系，其中两个肽段（P33-47和P41-55）被两位供者共享。T细胞表位位于跨越CDR1-CDR2的区域和CDR3内。所有这些区域都对应于非人源序列，这与其它治疗性抗体的发现一致。这种定位有助于解释胚系化76G3、人源化76H和野生型76之间T细胞反应的差异。胚系化将人源序列引入CDR1和CDR3侧翼区域，从而减少了可能引发T细胞反应的非人源9肽的存在。CDR3中存在T细胞表位支持了VHH中V、D和J重组可以产生新表位的观点。这也表明，与常规抗体相比，VHH中更长的CDR3可能会增加新表位产生的风险。与CDRs重叠的T细胞表位与抗原特异性相关，因此对每个纳米抗体是独特的，这可能解释了纳米