计算分析揭示抗体Fab区非共有N-糖基化位点的OST结合机制与调控策略

《mAbs》：Computational analysis reveals non-consensus N-glycosylation sequons in antibody Fab region

本综述通过计算建模与实验验证相结合，系统阐明了抗体Fab区非共有N-糖基化位点（non-consensus N-glycosylation）的识别机制。研究揭示了寡糖转移酶（OST）复合物对非共有序列的底物特异性，证实了芳香族氨基酸在增强OST结合亲和力中的关键作用，并建立了可预测糖基化占据率（glycan occupancy）的计算工作流程。该成果为治疗性抗体开发中糖基化质控属性的评估与优化提供了新范式。

　　

摘要

蛋白质的天冬酰胺糖基化通常发生在共有基序上。然而，近期研究报道了非共有位点N-糖基化的实例，尽管这些非典型修饰的机制和影响尚不清楚。本研究在人类抗体Fab区发现了糖基化占据率较低的新型非共有N-糖基化基序。我们开发了一种计算工作流程来预测非共有肽段与真核生物寡糖转移酶（OST）复合物之间的相互作用。该模型通过天冬酰胺残基周围的定点诱变和质谱糖基化定量得到验证。结果表明，通过影响OST结合亲和力的突变可以调节非共有位点的聚糖占据率。OST活性的药理学抑制降低了Fab和Fc区的非共有及共有糖基化。此外，我们在天然人类抗体中发现了新的非共有糖基化位点，揭示了控制这些修饰的序列偏好。这些发现为OST序列特异性提供了机制性见解，并建立了评估非典型N-糖基化的计算和分析框架，有助于治疗性抗体开发中的糖谱控制。

引言

天冬酰胺连接糖基化是一种蛋白质翻译后修饰，其中天冬酰胺残基共价连接到一个寡糖上，在蛋白质折叠、溶解度、运输和功能中起着至关重要的作用。N-糖基化通常发生在共有序列N-X-S/T上，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，后跟丝氨酸或苏氨酸。然而，它也可能发生在非共有位点，尽管频率较低。几项研究报道了各种人类糖蛋白中独特的非共有糖基化基序，包括N-X-C、N-X-V和反向共有基序S/T-X-N。非共有位点的糖基化可以显著影响蛋白质的结构和功能。例如，Sda/Cad合酶在其高尔基体腔内结构域包含一个N-X-C基序内的保守糖基化位点。该糖化位点的突变诱导耗竭改变了高尔基体定位，降低了表达水平并损害了酶活性。在非共有位点，糖基化的可预测性较差，并可能受到局部蛋白质结构和细胞环境等因素的影响。非共有糖基化的潜在机制和影响仍然难以捉摸。

在抗体背景下，非共有糖基化可能导致其治疗特性的变化，包括结构、结合亲和力和药代动力学的改变。人类抗体根据其重链的序列和结构分为五种同种型（IgM、IgD、IgG、IgA和IgE），其中IgG是人类血浆中最丰富的同种型。IgG抗体在Fc区包含一个保守的共有N-糖基化位点，其中聚糖变异调节Fc受体结合和下游抗体依赖性细胞毒性。糖基化也可能发生在Fab区，大约10%的人类IgG分子含有Fab糖基化。这被认为是在体细胞超突变过程中掺入共有基序而产生的。在抗体的Fab区已经鉴定出几种非共有基序，包括重链C_H1结构域中的N-S-G基序和轻链互补决定区中的N-E-N基序。尽管Fab聚糖出现频率较低，但它们可以影响抗原识别以及抗体折叠和稳定性。已证明抗瓜氨酸蛋白抗体可变区内的共有聚糖位点可以调节抗原结合和免疫反应。此外，肺鳞状细胞癌来源的IgG在C_H1结构域内包含一个N-S-G糖基化位点，该位点参与CIgG-整合素-FAK信号传导和致癌功能。此外，N-聚糖可能成为治疗性抗体中的关键质量属性，影响产品的安全性和有效性。理解非共有糖基化的模式和机制对于优化抗体工程和改进其治疗特性至关重要。

N-糖基化在内质网中由寡糖转移酶启动，该酶催化前体寡糖从脂质连接的多萜醇-PP供体转移到新生多肽链上的受体天冬酰胺上。真核生物OST有两种不同的形式（OST-A和OST-B），并以共翻译或翻译后方式修饰糖基化位点。寡糖随后在高尔基体中进行加工，通过葡萄糖苷酶修剪葡萄糖残基，并通过糖基转移酶添加其他糖部分。

真核生物OST是一个多亚基蛋白质复合物，包含负责跨膜定位、配体结合和催化的多个结构域。最近的一项冷冻电镜结构揭示了人类OST-B复合物的STT3B催化亚基内配体肽的结合。提出的酶促机制表明，STT3活性位点中的天冬氨酸残基与受体天冬酰胺形成氢键，促进寡糖的亲核攻击。该天冬氨酸残基在物种间高度保守（人类STT3B中的Asp103，细菌OST中的Asp56，酵母STT3中的Asp47）。一个独立的Trp-Trp-Asp环与共有序列（N-A-T）的+2位苏氨酸相互作用，有助于配体结合和定位。几项研究表明，OST对N-X-T基序的结合亲和力高于N-X-S基序。?2、?1、+1和+3位的氨基酸影响糖基化效率和占据率，如在细菌OST催化的糖基化中所观察到的。另一项研究显示，在共有序列的?2位引入芳香族残基可增加人类细胞中的聚糖占据率。这些发现表明，特定序列的聚糖占据率与OST结合特异性和亲和力相关。

在这项研究中，我们研究了氨基酸序列如何影响非共有N-糖基化位点的酶结合和糖基化效率。使用在人类IgG1抗体（mAb-1）Fab区发现的非共有基序作为模板，我们进行了计算对接和残基扫描，以预测肽段与人类OST-B复合物的结合。然后我们生成突变抗体来检查序列变异对聚糖占据率的影响。我们的结果表明，OST活性位点内增强的拟合促进了非共有位点的糖基化。值得注意的是，在?1位引入芳香族残基和在+2位引入天冬酰胺显著增加了糖基化。对天然抗体序列的分析揭示了类似的模式，加强了我们对非共有糖基化机制的理解。尽管共有位点的聚糖占据率要高得多，但非共有基序可能仍符合治疗分子中的关键质量属性，需要仔细评估和生产控制。这项研究建立了一个用于评估非共有基序聚糖占据率的预测性计算工作流程，为抗体序列设计和治疗优化提供了宝贵的见解。

结果

肽段与OST复合物的对接

由于寡糖转移酶在启动聚糖转移中的关键作用，我们研究了非共有序列与真核生物OST的结合。我们从蛋白质数据库（PDB: 6S7T）中获得了已发表的OST-B结构，其参考肽结合在STT3B催化亚基中。参考配体是一个包含共有N-糖基化序列（AANATAA）的7氨基酸肽。使用分子操作环境平台，我们分析了各种非共有序列的对接得分、结合亲和力和热稳定性，以评估OST序列偏好。

首先，我们将mAb-1分子Fc区发现的共有序列（QYNSTYR）作为对照进行对接。由于肽段具有高构象灵活性，我们在定义的能量窗口内进行构象搜索，为肽段生成构象库。然后使用现有的肽构象和三角匹配放置及刚性受体精修方法进行分子对接。此过程生成了200个按对接得分排序的构象。我们选择了具有最负对接得分并在天冬酰胺和催化性Asp103之间形成氢键的构象，这有助于聚糖转移过程中的亲核攻击。二维相互作用显示，苏氨酸与受体Trp604形成氢键，这与先前显示STT3B中WWD环促进配体结合的研究一致。

接下来，我们对mAb-1 Fab区鉴定的非共有基序（N-Y-G）进行对接。非共有肽的对接产生了?10.1332 kcal/mol的负对接得分。与具有?12.1643 kcal/mol对接得分的共有对照序列相比，非共有序列显示出与OST复合物的结合亲和力略有降低。然而，N-Y-G基序内的天冬酰胺残基与Asp103形成了强相互作用，并且Gly的主链氮与WWD环中的Asp606形成氢键。这些结果表明，N-Y-G基序可以拟合到STT3B催化位点，从而促进N-糖基化。

评估序列变异对OST结合的影响

为了进一步评估OST识别非共有序列的序列偏好，我们使用残基扫描模块在非共有肽中天冬酰胺残基周围计算生成点突变，并计算包括结合亲和力和热稳定性在内的配体性质。这种高通量分析作为对接分析的正交方法，能够识别稳定、高亲和力的肽段。将?2、?1、+1和+2位的每个残基分别替换为其余19种天然氨基酸。生成热图以显示与野生型肽相比的相对结合亲和力和热稳定性。负的ΔAffinity和ΔStability值表示更强的结合亲和力和增加的肽稳定性。

在?1和+2位用苏氨酸和甘氨酸取代显著改善了结合亲和力和稳定性，而在?2位用苯丙氨酸取代则降低了肽的性质。突变肽的对接分析揭示了对接得分与肽性质（ΔAffinity和ΔStability）之间的正相关性。选择了14个突变用于体外抗体生成和糖基化分析。值得注意的是，诸如T30F、G33N、T30R和T30Y等突变体预计会表现出与STT3B更强的相互作用，这得到了它们负的ΔS、ΔAffinity和ΔStability值的支持。总的来说，这个计算工作流程提供了一个用于评估OST与非共有序列结合的预测模型。

非共有位点聚糖占据率的表征

为了评估非共有位点的低丰度糖基化，我们开发了一种使用PNGase F进行去糖基化，然后进行胰蛋白酶消化和基于质谱的肽图分析的方法。PNGase F消化去除N-聚糖并在天冬酰胺上留下一个脱酰胺修饰，质量位移为+0.988 Da。使用PNGase F进行去糖基化是一种广泛使用的糖蛋白分析方法。由于Fab聚糖有限的表面暴露，我们评估了在样品制备不同阶段添加PNGase F的效率。通过质谱定量脱酰胺水平，并通过有无PNGase F处理的样品中脱酰胺的差异确定聚糖占据率。我们发现，在二硫键还原和烷基化后添加PNGase F可有效去除Fab和Fc区的N-聚糖。我们进一步评估了PNGase F处理时间对肽段脱酰胺和糖基化定量的影响。我们发现更长的处理时间后脱酰胺没有显著增长，这表明该方法可以有效检测糖基化位点，而不会在样品制备过程中引入人为脱酰胺。

为了进一步确认mAb-1 Fab区的糖基化，我们进行了尺寸排阻色谱和完整质量分析。IdeS消化和还原后，mAb-1的Fc、Fd和轻链片段通过SEC分离。在Fd主峰附近观察到一个肩峰，表明Fd区可能存在聚糖修饰。我们分离了这个肩峰组分，并通过完整质量分析鉴定了更高分子量的物种。肽图分析进一步证实了重链N-Y-G肽上存在含有唾液酸的聚糖。这些结果共同证实了mAb-1 Fab区内的糖基化位点。

通过诱变调节非共有位点的聚糖占据率

为了验证图2中计算预测的非共有序列，我们在Fab糖基化位点的天冬酰胺残基周围引入单点突变，并定量突变抗体中的N-聚糖占据率。野生型和突变型抗体均在ExpiCHO细胞中表达，并使用Protein A柱纯化。总共生成了16种抗体，并使用PNGase F介导的去糖基化结合肽图分析评估糖基化水平。在+2位引入苏氨酸以创建共有序列的阳性对照突变体（G33T）在Fab区显示出高糖基化（99.1%），表明该Fab糖基化位点可进行聚糖修饰。相比之下，阴性对照突变体（N31A）未显示可检测到的糖基化。在其余变体中，有7个表现出增加的Fab糖基化，其中T30F和G33N与野生型相比显示出统计学显著增加。Fc区糖基化不受Fab区突变的影响。

我们进一步评估了突变序列的对接谱。我们发现糖基化变体表现出比非糖基化变体更负的对接得分，表明与STT3B的结合更强。这有力地支持了我们的计算分析，并表明对接得分可用于预测非共有序列中的糖基化频率。具体来说，在G33N突变体中，+2位引入的天冬酰胺与WWD环形成氢键，模拟了共有序列中观察到的相互作用。在T30F突变体中，?1位的苯丙氨酸残基与Glu101形成芳烃-H相互作用，增强了受体结合。

为了研究非共有糖基化过程中对OST复合物的依赖性，我们在抗体生产过程中用OST复合物抑制剂NGI-1处理细胞。在G33N突变体中，Fab区的非共有糖基化被NGI-1处理消除，而Fc区的共有糖基化被NGI-1处理以剂量依赖性方式降低。在G33T突变体中，共有位点的Fab和Fc糖基化均被NGI-1处理降低，其中Fc聚糖显示出更强的降低。总之，这些发现支持非共有位点的糖基化是序列依赖性的，并受与OST复合物相互作用的影响。

Fab和Fc区含有不同的N-聚糖结构

为了研究Fab和Fc聚糖之间的差异，我们使用质谱分析了G33T和G33N突变体中聚糖结构及其丰度。在Fab和Fc位点聚糖占据率相当（分别为99.1%和96.3%）的G33T突变体中，我们检测到10个Fab特异性聚糖、1个Fc特异性聚糖和9个共享物种，表明Fab区聚糖多样性更高。值得注意的是，常见的双天线聚糖包括G1F和G2F在Fab区显著富集，而Fc区则富含G0F和高甘露糖物种如Man5。

在G33N突变体中，由于Fab糖基化位点的低聚糖占据率，一些聚糖物种无法检测到。我们发现Fab区G1F水平高于Fc区，与G33T聚糖谱一致。这些数据表明，Fab聚糖具有与Fc不同的聚糖形式分布，这可能是由于局部蛋白质结构影响了不同聚糖加工酶的可及性。

分析天然抗体中自然存在的非共有序列

为了进一步评估天然抗体中非共有N-糖基化的序列偏好，我们分析了人静脉注射免疫球蛋白（IVIg），它包含来自大量健康供体的IgG，广泛用于免疫调节和抗炎治疗。我们首先使用接骨木凝集素（SNA）结合色谱法富集Fab糖基化抗体。我们发现9.88%的IVIg被SNA结合富集。由于缺乏IVIg的序列信息，我们对富集的抗体进行了肽图分析，并使用PEAKS DeepNovo分析了糖肽序列，这是一种基于深度学习的从头肽段测序和PTM分析工具，不需要参考数据库。使用PNGase F消化去除N-聚糖，从而能够检测脱酰胺修饰并简化从头测序过程。通过聚糖分析和数据库搜索进一步验证了鉴定出的序列。

该工作流程鉴定出10个非共有序列和7个共有糖基化序列。我们能够检测到先前报道的糖肽，如SWNSGAL、SGNSQES和QYNSTYR，证实了该方法的可靠性。此外，我们在重链和轻链可变区发现了新的糖基化基序，这些基序以前未被报道。我们在人类蛋白质数据库（PeptideAtlas）中验证了这些序列，并进行了对接分析。我们发现共有肽段表现出比非共有肽段显著更负的对接得分，表明天然抗体中OST偏好共有序列。对接得分与结合亲和力得分呈正相关，与我们之前的数据一致。疏水残基（例如Tyr、Phe、Trp、Ala、Val）经常在N-糖基化基序的?1位观察到。这些结果为了解天然抗体中非共有N-糖基化所涉及的序列偏好提供了进一步的见解。

为了评估非共有基序在天然免疫库中的普遍性，我们搜索了Observed Antibody Space，并分析了一个包含来自健康队列初始B细胞的抗体序列的已发表数据集。该研究中的序列是使用RNA测序获得的，未评估蛋白质糖基化。我们计算了先前鉴定的非共有基序在天然抗体中的频率，发现YLNWYQQ出现频率最高（12.3%）。接下来，我们在治疗性抗体数据库Thera-SAbDab中搜索这些非共有基序，发现它们的频率范围约为0-3%。由于非共有位点的低聚糖占据率，这些治疗性抗体中的糖基化可能不易检测到。总的来说，这些数据可以为未来在抗体开发过程中评估非共有糖基化的努力提供信息。

讨论

在本研究中，我们开发了一个计算建模工作流程来预测非共有序列的OST结合和N-糖基化频率。我们在计算分析过程中发现了分子对接得分与肽性质之间的正相关性，这有助于预测真核生物OST复合物的肽结合和糖基化。使用单克隆抗体mAb-1作为模型，我们研究了序列变异对Fab区糖基化的影响。我们的研究结果表明，非共有位点的糖基化是序列依赖性的，并与OST复合物的识别相关。

OST在非共有位点的序列偏好尚未完全了解。最近关注共有位点的研究增进了我们对OST结构和配体相互作用的理解。一项关于人类OST的研究表明，在?2或?1位含有芳香族残基的序列显著增加了聚糖占据率。与这些发现一致，我们的研究鉴定了一个在?2位含有芳香族苯丙氨酸残基的非共有糖基化位点。该苯丙氨酸残基朝向STT3B结合口袋内的疏水斑块，可能促进肽结合。残基扫描分析显示，将该苯丙氨酸突变为其他氨基酸会降低配体性质。此外，我们发现将?1位氨基酸突变为芳香族残基（Phe或Tyr）增强了非共有位点的糖基化。我们进一步分析了人类免疫球蛋白中自然存在的糖基化位点，发现在与OST复合物结合更强的共有和非共有序列中频繁存在芳香族残基（Phe、Tyr和Trp）。同时，将?1位氨基酸突变为带正电荷的精氨酸残基也增加了T30R突变体中的糖基化。这可能是由于Arg与STT3B结合口袋内?1位氨基酸周围的带负电荷蛋白质斑块相互作用。我们的研究提供了对非共有糖基化位点背后规则的理解，这可能有助于抗体中糖基化的预测和调节。

此外，我们鉴定出N-Y-N序列的聚糖占据率高于其他变体。值得注意的是，该肽的预测配体相互作用密切模仿了共有序列，其中+2位的天冬酰胺与WWD环形成氢键，促进配体结合和定位。这与先前一项在单克隆抗体中鉴定出N-X-N糖基化基序的研究一致。我们进一步发现，使用NGI-1药理学抑制OST消除了N-Y-N基序的非共有糖基化，表明该非典型位点的糖基化机制依赖于OST途径。总之，这些发现表明非共有位点的糖基化遵循由OST催化的酶促机制，类似于共有位点，并且聚糖占据率受OST结合亲和力影响。因此，非共有N-糖基化的发生可能归因于真核生物OST的广泛底物特异性。

当前控制抗体中N-糖基化和聚糖形式多样性的生产策略包括细胞系选择、糖基化途径的遗传调控以及优化培养基和条件。这些策略主要侧重于控制Fc区共有序列中的聚糖多样性，这在ADCC中起主要作用。然而，由于它们的低频率，非共有聚糖尚未得到很好的表征。最近的研究强调，Fab糖基化通常涉及非共有位点，并且可以影响抗体功能，突出了理解和控制非共有糖基化的重要性。在我们的研究中，我们在人IVIg中鉴定了新的非共有基序，并评估了它们来自人类初始B细胞的抗体库中的普遍性。这些基序可能有助于治疗性抗体的关键质量属性，需要在抗体发现和开发过程中仔细评估。

为了促进我们的发现在抗体工程中的应用，我们提出以下可操作指南。首先，分析蛋白质序列以识别非共有N-糖基化基序，特别是N-X-N基序或在Asn的?1位具有疏水残基（如Tyr、Leu或Phe）的基序。其次，进行计算对接分析以预测OST与已识别的非共有基序的结合。第三，对于含有高亲和力基序的抗体，进行分析研究——如完整质量分析、肽图分析或释放的聚糖谱分析——以实验评估这些位点糖基化的存在程度和范围。在质谱分析过程中，重要的是将非共有聚糖修饰纳入数据分析，以确保准确检测和定量这些聚糖，包括那些携带唾液酸的聚糖。最后，在非经典位点的糖基化不理想的情况下，替换天冬酰胺残基或改变周围序列以破坏基序并消除糖基化。总之，这些步骤可能有助于降低生产过程中意外糖基化的风险，从而确保治疗产品的质量，这有助于其安全性和有效性。

通过揭示新的非共有糖基化基序，我们的研究提出了未来研究的问题和方向。我们发现Fab聚糖比Fc聚糖表现出更高的结构多样性，并且NGI-1对OST的抑制更强烈地阻断Fc糖基化。这些差异可能源于Fab和Fc区之间的局部结构变异，这可能会改变它们在翻译后糖基化过程中对OST的亲和力，以及在不同糖基转移酶在聚糖加工过程中的亲和力。为了更好地理解这些机制，未来的研究可以包括OST结合的结构分析，并研究其他糖基转移酶在塑造Fab聚糖多样性中的作用。此外，我们在凝集素富集后在人IVIg中鉴定了几种新的非共有基序。虽然我们的分析在肽段水平确认了聚糖修饰，但需要进一步的研究来确定携带这些基序的单个抗体内的糖基化程度。

总之，我们的研究利用计算建模和体外诱变表征了OST结合非共有基序的序列特异性。我们的结果表明，?1位的芳香族和带正电荷残基增强了与真核生物OST的结合，有助于增加糖基化。这项研究解决了理解意外位点糖基化的空白，并提供了预测和表征非共有糖基化的工具。这些发现有助于在生物制剂开发过程中改进序列设计和糖基化预测。

材料与方法

计算分析

肽段对接：计算建模在MOE软件中进行。OST受体结构从蛋白质数据库（PDB: 6S7T）获得。该结构作为生物分子组装加载到MOE中，并使用默认设置进行准备以分配键序和质子化状态。参考配体AANATAA用作模板，使用蛋白质构建器模块设计包含非共有序列的7氨基酸肽。设计的肽进行侧链重排和最小化。使用刚性肽骨架和LowModeMD方法进行构象搜索，RMS梯度为0.5，能量窗口为50，而其他参数设置为默认值。生成的构象数据库作为现有配体构象加载到对接模块中。受体原子用作对接受体，参考配体口袋用作对接位点。使用三角匹配器的放置方法进行对接，使用London dG得分生成200个构象，并使用刚性受体的精修方法，使用GBVI/WSA dG得分生成200个构象。对产生的对接数据库进行筛选，寻找受体Asn和Asp103处的受体-配体相互作用，以选择具有最高对接得分的构象。

残基扫描：使用参考肽骨架构建原始FTNYGMN肽并进行能量最小化。将?1、+1和+2位的氨基酸分别突变为19种天然氨基酸。计算配体原子的结合亲和力和热稳定性。

抗体建模：使用抗体建模器模块从蛋白质序列构建mAb-1的结构。将序列导入MOE，并使用IMGT编号方案和1个最大CDR和框架数作为默认值对完整IgG结构进行建模。

肽图分析

样品制备：蛋白质在含有4 M盐酸胨、80 mM Tris、9.3 mM二硫苏糖醇的溶液中于37°C还原30分钟。然后加入44 mM碘乙酰胺，在室温下烷基化半胱氨酸30分钟。使用离心柱将混合物进行缓冲液交换，缓冲液含有20 mM pH 5.2的醋酸钠。测量蛋白质浓度以计算胰蛋白酶/Lys-C的量，以达到1:5（w/w）的酶:蛋白质比例。酶消化混合物在37°C孵育5小时。然后向混合物中加入0.5%三氟乙酸以灭活酶。

对于去糖基化，评估了三种方法。在第一种方法中，在还原/烷基化之前添加快速PNGase F，每100 μg蛋白质加入3 μL酶，并在37°C孵育1小时。在第二种方法中，在缓冲液交换步骤后以相同比例添加PNGase F。在第三种方法中，将消化的肽在SpeedVac真空浓缩器中干燥，重新溶解在50 mM pH 7.5的Tris中，并用PNGase F消化。

仪器：将20 μg肽段上样到Q Exactive HF Orbitrap上。肽段在40°C设置的反相ACQUITY UPLC HSS T3柱上分离。流动相A含有水中0.1%甲酸，流动相B含有90%乙腈和10%水中0.1%甲酸。流动相B的比例设置为：0–5分钟：恒定0.1%；5–91分钟，从0.1%到40%；91–95分钟：40%到60%；95–95.1分钟：60%到90%；95.1–99分钟：恒定90%；99.1–120分钟：90%到0.01%。肽段通过214 nm紫外吸收进行分析，然后进行MS/MS分析。数据在200至3,000 m/z的范围内以2 m/z的隔离窗口获取。正离子模式的源电压设置为3 kV。离子传输管温度设置为300°C，毛细管温度设置为275°C。鞘气、辅助气和吹扫气的流速分别设置为40 μL/min、10 μL/min和1 μL/min。色谱峰的半峰全宽设置为15秒。数据以数据依赖模式获取，一次全MS扫描后跟随着检测到的前10个最强离子的MS/MS扫描，最小阈值计数为1.5e5。默认电荷状态设置为2。全MS扫描使用60,000的分辨率、5e6的AGC目标、60毫秒的最大注入时间和1次微扫描进行采集。MS2扫描使用30,000的分辨率、5e6的AGC目标、200毫秒的最大注入时间和1次微扫描进行采集。阶梯归一化碰撞能量设置为28%。重复前体离子的动态排除时间设置为5秒。

数据分析：使用Byosphere中的PTM模块处理原始数据。仪器参数设置为前体质量容差10 ppm，碎片质量容差20 ppm。肽段切割位点设置为赖氨酸和精氨酸残基的C端，具有完全特异性消化且无遗漏切割。使用的翻译后修饰列于补充数据2。每个肽段的最大常见修饰数设置为2，稀有修饰设置为1。其他参数设置为默认值。所有样品的序列覆盖率均达到>95%。

尺寸排阻色谱：使用Waters Acquity H-Class UPLC系统和ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱在25°C下分析富含肩峰的抗体组分。使用含有5%异丙醇、400 mM