无标记植物根系与微生物结构成像：基于三谐波激发显微技术的原位研究

《Scientific Reports》：Label-free structural imaging of plant roots and microbes using third-harmonic generation microscopy

本研究针对植物根系在自然环境中难以原位成像的瓶颈，结合微流控生态系统（EcoFABs）与三谐波激发（THG）和三光子荧光（3PF）显微技术，实现了活体根系及根际微生物的无标记、高时空分辨率结构成像。THG技术成功揭示了根系维管束、凯氏带、分生细胞及根冠细胞等关键结构，并首次实现对细菌、真菌细胞壁的标记自由可视化。该研究为根系生物学、植物-微生物互作研究提供了突破性工具，对可持续农业与气候变化应对具有重要价值。

　　

植物根系被誉为植物的“隐藏的一半”，其在土壤修复、气候变化响应及可持续农业中具有核心地位。然而，由于土壤环境对光线的强烈散射与吸收，根系结构的原位高分辨率成像始终是技术难点。传统荧光显微技术依赖外源标记，易干扰生物活性，且难以穿透不透明组织。这一局限严重阻碍了根系发育、逆境响应及微生物互作等关键生物学过程的研究。

为突破这一瓶颈，研究团队创新性地将微流控生态系统（EcoFAB）与非线性光学显微技术相结合。EcoFABs通过可控的无土环境为植物提供生长条件，同时保障光学通路的畅通。利用三谐波激发（THG）和三光子荧光（3PF）显微技术，团队实现了对活体根系及根际微生物的无标记、深层组织成像。THG作为一种相干非线性光学过程，通过三光子激发产生信号，其对比度源于焦点内光学异质性，尤其适用于细胞壁等界面结构成像；3PF则捕获内源荧光信号，二者可同步采集，互补提供结构与分子信息。

研究以禾本科模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）和双子叶模式拟南芥（Arabidopsis thaliana）为对象，通过定制多模态显微镜（1300 nm激发波长，NA 1.05水浸物镜）进行成像。关键技术包括：THG/3PF信号分离检测、点扩散函数校准（横向分辨率0.65 μm，轴向1.78 μm），以及EcoFAB中植物无菌培养与微生物接种（如Pseudomonas simiae细菌和Trichoderma atroviride真菌）。

THG显微术以亚细胞分辨率提供植物根系结构的无标记对比度

THG信号清晰呈现根系表皮、皮层、内皮层及维管束的细胞壁结构，其强度显著高于3PF自发荧光。在深层组织（>200 μm）中，THG成功识别出凯氏带（Casparian strip）的条纹状结构，其光学异质性导致信号增强，而3PF通道未见类似响应。

THG与3P自发荧光显微成像二穗短柄草根成熟区

在成熟区，THG与3PF信号共同定位于细胞壁，但THG强度高出3.4–8.8倍。内皮层凯氏带在THG图像中呈现亮条纹（宽度约10 μm），其位置与形态符合调控水分运输的屏障结构特征。维管束以平行通道形式在深度140 μm处清晰可见。

THG与3P自发荧光显微以亚细胞分辨率成像二穗短柄草根伸长区、分生组织及根尖

在分生组织区域，THG清晰显示核膜与核仁（推测因其光学密度差异），而3PF捕获核酸自发荧光。研究人员观察到细胞分裂过程，包括子核分离及细胞壁突起现象。根尖成像中，THG识别出分生组织与根冠边界，并发现淀粉颗粒（3–7 μm）及可能为应激颗粒的微小 puncta（1–3 μm）。

THG与3PF显微术实现植物根系与根际微生物同步成像

THG通过细菌与真菌细胞壁产生无标记对比，成功可视化根际Pseudomonas simiae细菌聚集与运动（包括静止、慢速与快速移动个体），以及Trichoderma atroviride菌丝、孢子（4–6 μm）与细胞核。结合GFP标记，多模态成像可特异性追踪微生物与根系互作。

本研究通过THG显微术与EcoFAB平台的结合，首次实现了活体植物根系及微生物的无标记、深层组织、亚细胞分辨率成像。THG不仅能清晰展示根系解剖结构（如凯氏带、维管束、分裂细胞），还可可视化根际微生物的动态行为。尽管THG缺乏分子特异性，其与3PF的联用为研究根系发育、环境响应及微生物互作提供了强大工具。该技术避免了标记引入的扰动，适用于长期活体观测，为可持续农业与植物逆境生物学研究开辟了新路径。