COL4A4基因变异谱系拓展：基于最新Alport肾病分类的19例中国儿童基因型-表型相关性研究

《Renal Failure》：Expanding the COL4A4 variant spectrum: genotype-phenotype correlation in 19 Chinese children using updated Alport kidney disease classification

本研究首次将Alport肾病新分类应用于携带COL4A4变异的中国儿科患者，通过鉴定17个变异（10个新发现），揭示移码/错义变异与不同程度肾病相关而无义变异导致孤立性血尿，为精准诊断和基因型-表型关联提供新视角。

　　

引言

COL4A4基因编码IV型胶原α4链，该蛋白包含N端7S结构域、三螺旋胶原结构域和C端非胶原（NC1）结构域。IV型胶原α4链与高度同源的α3(IV)和α5(IV)链组装成异源三聚体胶原结构，在肾小球基底膜（GBM）及其屏障功能中起关键作用。IV型胶原基因变异导致胶原IVα345支架缺失或功能障碍，引起从薄基底膜肾病（TBMN）到Alport综合征（AS）的疾病谱，后者以血尿、蛋白尿、进行性肾功能障碍、感觉神经性听力损失和眼部异常为特征。AS肾脏病理通常表现为GBM弥漫性不均匀增厚，伴分裂、撕裂、层状或篮网状改变。

Alport综合征主要分为X连锁Alport综合征（XLAS，由COL4A5基因变异引起）和常染色体显性（ADAS）或常染色体隐性（ARAS）形式（由COL4A3或COL4A4基因变异引起）。XLAS约占AS病例的80%，ARAS约占15%，ADAS约占5%。TBMN，历史上称为良性家族性血尿，是一种常染色体显性遗传病，以持续性或复发性肾小球性血尿、GBM变薄和肾功能正常为特征。COL4A3或COL4A4基因的杂合致病性变异常见于家族性血尿患者，受累个体极少出现听力或眼部异常。TBMN通常临床病程良好，无需特殊治疗，但约10%-20%的患者可能进展至肾衰竭。

传统命名法被认为过时且混乱，因此Kashtan等人提出了修订术语，强调不符合经典疾病标准的杂合子个体，以促进早期诊断和干预。该方案近期被Puapatanakul和Miner进一步完善和扩展，形成IV型胶原α345相关肾病的四级分类：严重经典AS、轻中度AS、伴有局灶节段性肾小球硬化（FSGS）的蛋白尿/肾病性Alport肾病以及血尿性Alport肾病。本研究采用这一更新分类，回顾性分析携带COL4A4变异的中国儿童的临床和病理数据，旨在拓展COL4A4基因变异谱系，探索基因型-表型相关性，为疾病诊断和预后提供更可靠基础。

材料与方法

患者与数据收集

研究纳入2017年1月至2024年4月期间因血尿（肉眼或镜下）或体检发现蛋白尿入住温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院的19例携带孤立性COL4A4变异（排除其他血尿或蛋白尿遗传原因）的儿童。获得所有参与者或其监护人的书面知情同意。伦理批准由温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院的机构审查委员会和医学伦理委员会授予。回顾性收集临床数据，包括性别、首次发现尿液异常年龄、临床表现、检查记录、治疗史、疾病进展、末次随访年龄和临床特征以及肾脏病家族史。对可行患儿进行肾活检，行光镜、电镜和免疫荧光检查。

遗传分析与变异评估

从参与者和家庭成员EDTA抗凝外周血样本中提取基因组DNA（gDNA），使用IDT的xGen Exome Research Panel v2.0进行全外显子组测序。使用在线生物信息学工具进行保守性估计和致病性预测。此外，使用SpliceAI和HSF Pro预测内含子变异和移码变异可能的剪接改变。本研究相关参考序列版本号为NM_000092.5。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南对变异进行分类。通过PCR后，对先证者和可行家庭成员进行Sanger测序验证目标序列变异。变异在HGMD和ClinVar数据库中进一步分析。

统计分析

正态分布的定量数据以均值±标准差表示，非正态分布数据以中位数（第25-75百分位数）表示。定性数据以计数和百分比表示。使用Mann-Whitney U检验比较截断变异组和非截断变异组的发病年龄。使用Pearson卡方检验或Fisher精确检验分析定性数据。P值小于0.05认为有统计学意义。

结果

COL4A4变异的分子特征

本研究共鉴定出17个不同的COL4A4变异，包括9个错义变异、4个移码变异、3个内含子变异和1个无义变异，均经Sanger测序证实。根据ACMG指南，3个被分类为致病性（P），6个为可能致病性（LP），8个为意义不明确（VUS）。最常见的复发COL4A4变异是先前报道的致病性无义变异p.Y1533*，占等位基因的18.2%（4/22），其次是新的错义变异p.P647A（2/22，9.1%），被分类为VUS。在错义变异中，甘氨酸替换最为普遍，占70.0%（7/10）。17个变异中有10个是新的。一名患者携带纯合变异，两名患者携带复合杂合变异。

COL4A4变异患者的临床特征

AS分类与临床表现和病理发现密切相关。19例儿童（男/女=11/8）中，大多数（12/19，63.2%）被分类为血尿性Alport肾病（历史上诊断为薄基底膜肾病）。3例（3/19，15.8%）被分类为第3组（伴有FSGS的蛋白尿或肾病性Alport肾病），4例（4/19，21.1%）为第2组（轻中度AS）。本研究无病例被分类为第1组（经典AS）。首次发现尿液异常的中位年龄为4.4岁（范围：2.5-6.1岁），末次随访中位年龄为9.3岁（范围：7.0-12.7岁）。肾脏表型主要以血尿和蛋白尿为特征，无进行性肾衰竭或经典AS典型的肾外表现证据。所有个体均存在血尿（15例镜下，4例肉眼），5例患者（5/19，26.3%）观察到蛋白尿，其中2例首次就诊时出现，3例随时间发展出现。蛋白尿发病中位年龄为7.0岁（2.6-9.6岁）。除患者18外，大多数患者有肾脏病或尿液检查异常家族史。患者18在1岁3个月时出现眼睑和下肢水肿、泡沫尿和肉眼血尿，根据低蛋白血症和高脂血症实验室发现诊断为肾病综合征。该患者携带来自父母的不同COL4A4变异，但无肾脏病家族史。

肾活检对诊断AS至关重要。四名儿童进行了活检。光镜显示轻微病变，患者7出现肾小球硬化，患者18出现节段性硬化。免疫荧光显示所有病例均无免疫复合物或补体沉积证据。GBM中α3和α5胶原链染色表明，两例α3和α5表达正常，另两例α3表达正常但节段性α5表达降低。电镜显示三例弥漫性GBM变薄（<180 nm），一例表现为不均匀GBM变薄（100-200 nm）伴节段性皱缩。

COL4A4变异的基因型-表型相关性

在本研究中，复合杂合和纯合患者被分类为轻中度Alport肾病，而大多数杂合患者被分类为蛋白尿性和血尿性Alport肾病。在杂合患者中，COL4A4的移码和错义变异与不同程度的Alport肾病相关，无义变异导致孤立性血尿。第3组和第4组包含最多样化的变异分类。本队列中无携带COL4A4变异的患者被分类为经典AS组。杂合患者中，截断和非截断变异组的发病年龄（首次发现尿液异常）无统计学显著差异。

讨论

IV型胶原的六种高度同源链（α1-α6）由COL4A1-COL4A6编码，形成三种不同的异源三聚体：α1α1α2(IV)、α3α4α5(IV)和α5α5α6(IV)。α1α1α2(IV)异源三聚体在胚胎发生期间是所有基底膜的主要成分，而α3α4α5(IV)异源三聚体成为成熟GBM以及耳蜗和眼晶状体基底膜的主要成分。因此，IV型胶原基因变异会损害基底膜，导致GBM变薄、分裂或分层，这是Alport综合征的标志性特征。在中国AS儿童队列中，大多数表现为肾小球性血尿和不同程度的蛋白尿，肾外受累极少。在一项儿童非选择性血尿的单中心研究中，11.9%（5/42）被发现携带COL4A4变异。

本研究鉴定出10个不同的新COL4A4变异（10/17）。其中，一个变异（患者14）根据ACMG指南分类为致病性，三个（患者3、10和16）被认为可能致病性。移码变异p.V238Efs18和p.D597Ifs56分别由Intron37-Exon38连接处16个氨基酸缺失和1785位点腺嘌呤缺失引起。物种保守性分析表明，位于三螺旋区的错义变异p.G1424A（患者10）和p.G320V（患者16）由于影响高度保守的氨基酸，可能破坏胶原结构的稳定性。对于意义不明确变异，使用不同的功能建模预测工具进行致病性评估。错义变异p.P647A被SIFT和PolyPhen-2预测为有害，解释其致病性需谨慎。对于c.489+34T>G，SpliceAI表明可能激活隐性供体位点（DS_DG=0.90），可能导致异常剪接事件。对于c.1623+100_1623+102del，HSF Pro预测了隐性受体位点的激活和剪接改变的可能。

研究鉴定出两个复合杂合变异和一个纯合变异。在患者18的家庭中，只有先证者（1岁时诊断为激素耐药型肾病综合征）表现出与FSGS一致的肾脏病理。该患者携带父源性错义变异（c.2447G>A/p.G816E），该变异先前报道与激素耐药型肾病综合征相关，但其携带相同变异父亲无症状。这与ACMG的临床意义未知分类一致。另一个未报道的内含子变异（c.1623+100_1623+102del）遗传自其无症状母亲，也被分类为VUS。在另一名复合杂合患者（患者19，携带两个内含子变异）中，注意到肾衰竭家族史，但无法对受累亲属进行基因检测。在患者16的家庭中，纯合变异携带者表现出轻度肾脏表型或无症状，可能表明性别和环境因素对基因外显率的潜在影响。

有趣的是，相同基因型导致不同表型。例如，携带未报道p.P647A变异的患者7比患者12症状出现更早，尽管两者均有肾脏病家族史。患者7的活检显示FSGS，她从7岁起接受ACE抑制剂（ACEI）治疗。相比之下，患者12在4岁时开始ACEI治疗，停药两年后尿液分析和肾功能正常。尽管分类为VUS，但家族史和临床发现提示p.P647A变异值得仔细考虑。在本队列中，所有携带致病性无义变异（c.4599T>G/p.Y1533*，曾在纯合子中报道）的患者均表现为血尿但无肾外表现，提示该变异杂合时可能与较轻表型相关。

据我们所知，这是首次将修订的Alport综合征分类应用于携带COL4A4变异的中国儿科患者队列的研究，拓展了COL4A4变异谱系，并提供了儿科患者基因型-表型关联的见解。为加强研究的转化和科学价值，所有经Sanger验证的新COL4A4变异（n=10）将按照HGVS命名规范上传至ClinVar。本研究队列衍生的结构化基因型-表型对数据集有潜力训练AI模型并整合到肾病遗传学的表型预测流程中。

目前，国际数据库如ClinVar和ACMG指南主要基于欧美数据，而gnomAD等公共数据库对非西方人群代表性不足，导致非西方人群变异致病性解读存在偏差。我们的工作有助于建立中国人群COL4A4变异谱系数据库，可显著减少变异误读导致的漏诊，为精准医学做出贡献。研究结果也可为遗传咨询和变异解读实践提供信息。新COL4A4变异及相关表型谱的鉴定可支持对表现为血尿的儿童进行更精确的遗传咨询，有助于区分TBMN和早期Alport综合征。此外，纵向随访提供了时间分辨的表型证据，通过贡献随时间推移的表型表达的真实世界证据，赋能未来的变异重分类工作，特别是意义不明确变异。同时，研究提供了人群特异性等位基因频率数据，对精准肾脏病学有价值，并增进了对东亚人群疾病表现的理解，强调了肾脏病学中人群特异性变异数据库的必要性，以提高诊断准确性并减少基因组医学中的健康差异。最后，我们的研究结果支持对血尿儿童进行早期基因检测以指导监测和家庭咨询。

然而，解释结果时需考虑几个局限性。首先，由于样本量（n=19）仅来自一个中心且仅限于儿科患者，结果普适性受限。其次，有限样本量导致统计比较效能不足。总之，在更大规模、多中心队列中复制之前，需谨慎解读研究结果。未来研究需要进一步阐明携带COL4A4变异的Alport肾病临床病程：（i）验证基因型-表型相关性的前瞻性纵向队列；（ii）新COL4A4变异的功能研究（剪接、蛋白建模）；（iii）基于结构化变异-表型数据集训练的AI驱动表型预测流程；（iv）东亚人群特异性变异数据库以减少错误分类偏差。