AIBP-LRP2介导的HDL摄取抑制CXCR4+干细胞样毛细血管扩张及侧支循环形成

《SCIENCE ADVANCES》：AIBP-LRP2–mediated HDL uptake restricts CXCR4+ stemlike capillary expansion and collateral circulation

外周动脉疾病等缺血性疾病中侧支循环形成机制不清。本研究通过蛋白质组学分析发现脂质代谢关键蛋白AIBP在患者血浆及缺血组织中显著上调。机制研究表明，髓系细胞来源的AIBP通过结合内皮细胞LRP2受体，促进HDL携带的miR-223内吞，进而抑制CXCR4+干细胞样毛细血管内皮细胞的扩增和动脉化进程。靶向AIBP的中和抗体可有效促进侧支血管生成，为缺血性血管疾病提供了新的治疗策略。

　　

当血管发生堵塞，人体的智慧在于能够启动“备选路线”——侧支循环（Collateral Circulation, CC），这就像是交通拥堵时开辟的绕行小道。在缺血性血管疾病，例如外周动脉疾病（Peripheral Artery Disease, PAD）中，侧支循环的形成对于恢复组织血流灌注至关重要，其发达程度与患者预后密切相关。然而，在成年个体中，驱动侧支循环形成的分子机制尚不明确，目前也缺乏有效的治疗手段来促进这一过程。传统观点认为，侧支循环主要通过动脉生成（Arteriogenesis，即预先存在的侧支动脉扩大）和动脉化（Arterialization，即毛细血管内皮细胞向动脉内皮细胞转化）来实现。近年来，趋化因子受体CXCR4信号通路在动脉发育和侧支循环形成中的作用逐渐受到关注，但其在成年下肢缺血中的具体调控机制仍有待揭示。组织缺血微环境，特别是由免疫细胞浸润等塑造的分泌蛋白组（Secretome），被认为是调控血管重塑的关键。为了寻找其中的关键调控因子，研究人员将目光投向了脂质代谢领域。

本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》，题为“AIBP-LRP2–mediated HDL uptake restricts CXCR4+ stemlike capillary expansion and collateral circulation”。研究人员通过无偏倚的蛋白质组学分析PAD患者血浆及小鼠股动脉结扎（Femoral Artery Ligation, FAL）模型缺血肌肉组织的分泌蛋白，发现脂质代谢通路，尤其是载脂蛋白A1结合蛋白（Apolipoprotein A1 Binding Protein, AIBP，亦称NAXE）的表达在缺血条件下显著上调，且其水平与PAD严重程度呈正相关。深入的机制探索揭示，AIBP作为髓系细胞来源的分泌蛋白，通过结合内皮细胞表面的内吞受体低密度脂蛋白受体相关蛋白2（Lipoprotein Receptor-Related Protein 2, LRP2），促进高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein, HDL）所携带的微小RNA miR-223的内吞，进而抑制CXCR4的表达，限制了一群具有干细胞特性的CXCR4⁺毛细血管内皮细胞（Capillary Endothelial Cells, CECs）的扩增及其向动脉内皮细胞（Arterial Endothelial Cells, AECs）的命运转变，最终抑制了功能性侧支血管的形成。相反，遗传敲除AIBP或使用中和抗体阻断其功能，则能有效促进侧支循环，改善缺血组织的血流灌注和功能恢复。这项研究不仅揭示了一种全新的侧支循环调控机制，还为治疗缺血性血管疾病提供了潜在的靶点。

为开展此项研究，作者团队运用了多种关键技术方法。研究纳入了PAD患者队列和健康对照者进行血浆蛋白质组学分析，并利用小鼠FAL模型模拟下肢缺血。技术层面主要包括：无偏倚蛋白质组学筛选、酶联免疫吸附测定（ELISA）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）及生物信息学分析（如细胞通讯分析CellChat、拟时序分析Pseudotime analysis）、流式细胞术、免疫荧光染色/共聚焦显微镜、微型计算机断层扫描（Micro-CT）血管成像、激光多普勒血流灌注成像、体外细胞功能实验（如细胞增殖/迁移实验、蛋白质相互作用验证Co-IP/邻近连接技术PLA）、TurboID邻近标记技术筛选相互作用蛋白、以及体内功能获得/缺失实验（如重组蛋白注射、基因敲除小鼠模型、内皮特异性AAV9-shRNA敲低、单克隆抗体中和治疗等）。

研究结果

无偏倚分泌蛋白分析揭示脂质代谢改变

通过对PAD患者血浆和FAL小鼠缺血肌肉的蛋白质组学分析，研究人员发现脂质代谢通路，特别是胆固醇代谢相关蛋白显著富集。其中，AIBP在PAD患者血浆和缺血组织中均显著上调，且其水平与踝肱指数（Ankle-Brachial Index, ABI）呈负相关，与疼痛无行走距离较短相关，提示AIBP高水平与PAD严重程度和侧支循环不良有关。在小鼠模型中，缺血后血浆和肌肉AIBP水平也升高。

细胞外AIBP来源于FAL后的白细胞并由缺氧诱导上调

流式细胞术分析显示，在FAL后的缺血组织中，单核细胞和中性粒细胞表面的AIBP表达显著增加。体外实验证实，缺氧可诱导单核细胞系（THP-1）中AIBP的表达和分泌。给野生型小鼠注射重组AIBP蛋白会抑制侧支血管形成、内皮细胞增殖和血流恢复，并加重组织坏死和功能障碍。

鉴定FAL后AIBP调控的干细胞样CXCR4⁺ CEC簇

对AIBP敲除（Apoa1bp^-/-）和对照小鼠缺血肌肉进行scRNA-seq分析，发现了四个内皮细胞亚群：两个毛细血管内皮细胞簇（CEC1和CEC2）、动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）。AIBP缺失特异性扩大了CEC2亚群的比例，该群细胞高表达CXCR4、干细胞特性相关基因和增殖标志物，并显示出较高的干性评分和代谢重编程特征。拟时序分析提示CEC2可能向CEC1和AECs分化。细胞通讯分析表明，巨噬细胞/中性粒细胞与CEC2亚群之间存在强烈的相互作用。

Apoa1bp缺失增加缺血后肢小口径侧支血管形成

在基础状态下，AIBP敲除不影响健康成年或早期 postnatal 小鼠的侧支血管。然而，在FAL诱导缺血后，AIBP敲除小鼠缺血肌肉中直径小于100微米的小侧支血管体积显著增加，动脉密度和内皮细胞增殖增强，伴随血流恢复改善和运动功能评分提高。但在经典的流体剪切应力驱动的动脉生成模型中，AIBP缺失并未表现出促进效应，提示其作用侧重于缺血早期的血管新生阶段。给Apoa1bp^-/-小鼠回补重组AIBP可逆转其促侧支循环表型。

AIBP缺失促进干细胞样CEC2的扩增和动脉转化

免疫荧光和流式细胞术分析显示，在缺血早期（第7天），AIBP敲除小鼠缺血组织中CXCR4⁺ CECs数量显著增加；至后期（第21天），则表现为CXCR4⁺ AECs的增加。整体mount染色进一步证实了CXCR4⁺ CECs的扩增及其向动脉的转变。将FAL后分离的CXCR4⁺ CECs移植给受体小鼠，能有效促进侧支血管生成和功能恢复。

CXCR4信号介导Apoa1bp缺失对侧支形成的影响

使用CXCR4特异性抑制剂AMD3100可阻断AIBP敲除带来的促侧支循环和功能改善效应。体外实验中，AIBP与HDL共同作用可抑制内皮细胞增殖和迁移，此效应依赖于CXCR4。

AIBP通过增强HDL相关miR-223的内皮摄取下调CXCR4

研究发现miR-223主要存在于HDL颗粒上。AIBP能促进内皮细胞对HDL及其携带的miR-223的内吞，从而增加细胞内成熟miR-223水平，进而抑制CXCR4的mRNA和蛋白表达。氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ）抑制网格蛋白（Clathrin）介导的内吞可阻断此过程。AIBP亦能破坏脂筏，但miR-223介导的CXCR4抑制与此过程相对独立。

脂蛋白受体相关蛋白2是介导AIBP功能的内皮受体

通过TurboID邻近标记技术结合质谱分析，鉴定出LRP2是AIBP在内皮细胞上的相互作用蛋白。Co-IP和PLA实验验证了AIBP与LRP2的结合。LRP2敲低可削弱AIBP介导的HDL摄取、miR-223内吞和CXCR4下调。体内内皮细胞特异性敲低LRP2可逆转重组AIBP注射对侧支血管形成、CXCR4⁺ CEC扩增以及miR-223/CXCR4表达的抑制作用。

中和细胞外AIBP可促进侧支血管形成

研究人员筛选出能有效中和AIBP功能的单克隆抗体MM02。在FAL模型中，给予MM02抗体治疗可显著增加侧支血管体积、动脉密度、内皮细胞增殖、CXCR4⁺ CECs（第7天）和AECs（第21天），降低缺血组织中CXCR4⁺ ECs的miR-223水平，并促进血流恢复、改善功能评分和减轻组织坏死。

研究结论与意义

本研究系统阐明了AIBP-LRP2-HDL-miR-223轴在限制缺血性侧支循环形成中的关键作用。研究提出了一个两阶段模型：第一阶段（出芽期），缺血微环境中髓系细胞来源的AIBP通过LRP2促进HDL-miR-223的内吞，抑制CXCR4⁺干细胞样CEC2亚群的扩增，限制了新生血管连接的建立；第二阶段（重塑期），持续的流体剪切应力驱动这些新生毛细血管成熟为功能性侧支动脉。该机制不同于以往强调的动脉内皮细胞重组装模型，突出了毛细血管内皮细胞在成年缺血组织修复中的可塑性及核心地位。

该研究的创新性在于：首次将脂质代谢关键分子AIBP与侧支循环调控直接联系起来；揭示了HDL作为miR-223载体非经典功能及其在血管重塑中的新作用；鉴定LRP2为AIBP在内皮细胞上的功能受体；发现了一群具有干细胞特性的CXCR4⁺ CEC2亚群是侧支形成的关键细胞来源；并证明了靶向细胞外AIBP（如MM02抗体）的治疗潜力。

这项研究不仅深化了对缺血环境下血管重塑机制的理解，挑战了传统观点，更重要的是为PAD等缺血性血管疾病的治疗提供了新的靶点和策略，即通过干预AIBP通路来激发内源性血管再生能力，具有重要的理论意义和临床转化前景。