ZDHHC14介导TEAD4棕榈酰化驱动肾脏免疫病理中Th17细胞招募的新机制

《Research》：ZDHHC14-Mediated TEAD4 Palmitoylation Drives Th17 Cell Recruitment in Renal Immunopathology

本研究聚焦于免疫球蛋白A肾病（IgAN）中Th17细胞浸润的调控机制。研究人员发现，在炎症环境下，受损肾小管上皮细胞通过转录因子TEAD4上调趋化因子CCL20的表达，从而招募Th17细胞，加剧肾间质纤维化。关键机制在于，TEAD4的活性受ZDHHC14介导的棕榈酰化（palmitoylation）修饰调控，而非蛋白表达量变化。体内实验证实，棕榈酰转移酶（PAT）抑制剂2-BP可有效减轻Th17细胞浸润及纤维化，延缓疾病进展。该研究首次揭示了蛋白棕榈酰化在肾脏免疫损伤中的核心作用，为靶向Th17驱动的自身免疫及纤维化疾病提供了新策略。

　　

在慢性肾脏病的庞大谱系中，免疫球蛋白A肾病（IgAN）是全球范围内最常见的原发性肾小球疾病之一。令人担忧的是，约有四分之一到三分之一的IgAN患者会在诊断后的20至30年内进展至终末期肾病（ESRD），给全球医疗卫生系统带来了沉重的负担。尽管近年来对IgAN发病机制的理解取得了显著进展，但其进展至ESRD的分子机制仍不完全清楚。越来越多的证据表明，除了经典的免疫复合物沉积机制外，肾小管间质区域的炎症损伤在疾病进展中扮演着关键角色。其中，辅助性T细胞17（Th17细胞）及其特征性细胞因子白介素-17（IL-17）被证实与慢性肾脏病（CKD）的严重程度呈正相关，Th17细胞介导的免疫损伤被认为是IgAN进展的关键推动因素。然而，驱动IgAN中Th17细胞向肾脏，特别是肾小管间质区域招募的具体分子机制，仍然是一个亟待解答的科学问题。

众所周知，Th17细胞通过其表面独特的趋化因子受体CCR6，被其唯一的配体CCL20所招募。但炎症环境下肾脏细胞，尤其是肾小管上皮细胞（TECs），如何上调CCL20的表达，其上游的转录调控机制为何，成为理解这一病理过程的核心。与此同时，蛋白质翻译后修饰（PTMs）是精细调控生命过程的关键机制。棕榈酰化作为一种可逆的脂质修饰，由ZDHHC家族棕榈酰转移酶（PATs）催化，并被酰基蛋白硫酯酶（APTs）去修饰，其在免疫调节中的作用日益受到关注，但在免疫介导的肾脏损伤中的角色尚属未知。

转录因子TEAD4是Hippo信号通路的关键下游效应器，其活性受到多种PTMs的精细调控。有趣的是，已有研究表明TEAD4的功能受棕榈酰化修饰调控，然而其在肾脏疾病，特别是免疫性肾病中的作用仍属空白。这引出了一个重要的科学问题：在IgAN的炎症环境中，TEAD4是否参与了CCL20表达的调控？其活性是否受到棕榈酰化修饰的调节？

为了回答这些问题，研究人员在《Research》杂志上发表了他们的最新研究成果。他们通过对IgAN患者样本和牛血清白蛋白（BSA）肾炎小鼠模型的分析，结合体外实验验证，揭示了一条全新的致病轴：ZDHHC14介导的TEAD4棕榈酰化驱动了Th17细胞的招募，从而加剧了IgAN的肾脏纤维化进展。

为开展此项研究，作者运用了多种关键技术方法。研究包含了19例IgAN患者和匹配健康对照的血清样本分析，以及3例人肾组织样本的检测。动物实验方面，建立了BSA肾炎小鼠模型，并在疾病不同时间点（12周和24周）进行分析和药物（2-BP）干预。细胞实验主要使用了原代小鼠肾小管上皮细胞（pmTECs）的炎症模型（LPS刺激）、Th17细胞与成纤维细胞共培养模型以及细胞迁移实验。分子机制探索中，广泛应用了蛋白质印迹（WB）、共免疫沉淀（Co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、DNA Pull-down、双荧光素酶报告基因检测、酰基-生物素交换（ABE）和Click-iT棕榈酰化检测、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）/免疫荧光（IF）染色、转录组测序以及代谢组学分析等技术。

Th17细胞浸润与IgAN-CKD严重程度正相关

研究人员首先在临床层面确认了Th17/IL-17轴与疾病的相关性。他们发现，IgAN伴CKD 3期患者血清中IL-17水平显著上调，且与估算肾小球滤过率（eGFR）呈负相关。在伴有肾小管间质病变的IgAN患者肾组织中，IL-17水平也更高。对IgAN患者肾组织转录组数据的分析进一步显示，Th17细胞分化通路被上调，并伴有纤维化相关通路的共同激活。在BSA肾炎小鼠模型中，随着疾病从12周进展到24周，小鼠出现了肾功能指标（血肌酐、尿素氮、尿蛋白）的恶化，以及肾小球病变和肾间质纤维化的加重。更重要的是，肾脏中Th17细胞（通过关键转录因子ROR-γ标记）的浸润显著增加，且主要位于肾小管间质区域。体外共培养实验证实，Th17细胞能够通过Bmp2/Smad1/5/9信号通路激活成纤维细胞，诱导其产生纤维化表型。这些结果确立了Th17细胞浸润与IgAN-CKD进展的正相关性，并揭示了其促进纤维化的下游机制。

趋化因子CCL20招募Th17细胞并受转录因子TEAD4调控

既然Th17细胞在肾间质富集，那么是谁在“召唤”它们？研究人员将目光投向了趋化因子CCL20。他们发现，在炎症刺激下，受损的肾小管上皮细胞会显著上调CCL20的表达。当与Th17细胞共培养时，这些“发炎”的上皮细胞表现出更强的Th17细胞招募能力。为了找到调控CCL20表达的“开关”，研究人员通过生物信息学分析预测并结合实验验证，发现转录因子TEAD4能够直接结合到CCL20的启动子区域，并显著增强其转录活性。DNA Pull-down和ChIP实验均证实了TEAD4与CCL20启动子的直接物理结合。这表明，肾小管上皮细胞通过TEAD4上调CCL20，从而为Th17细胞的浸润铺平了道路。

肾小管炎症引发TEAD4调控转换：从蛋白丰度依赖转向棕榈酰化依赖的活性调控

一个关键的问题是，炎症是如何“激活”TEAD4的？令人意外的是，无论是在疾病模型的肾组织中，还是在炎症刺激的肾小管上皮细胞内，TEAD4的蛋白表达水平并未发生明显变化。这提示，TEAD4对CCL20的转录调控可能不是通过改变其“数量”，而是通过改变其“活性”来实现的。已知棕榈酰化是调控TEAD4活性的重要PTM。研究人员发现，在BSA肾炎小鼠的肾组织中，棕榈酸的含量显著升高，为蛋白棕榈酰化提供了充足的底物。随后，通过ABE和Click-iT两种经典的棕榈酰化检测技术，他们证实TEAD4确实发生了棕榈酰化修饰，并且在炎症损伤的肾小管上皮细胞中，其棕榈酰化水平显著增强。这表明，在炎症环境下，TEAD4的调控机制发生了转换，从依赖于蛋白丰度转变为依赖于棕榈酰化修饰所激活的转录活性。

TEAD4 C367位点棕榈酰化对其转录调控CCL20至关重要

那么，TEAD4的哪个位点发生了关键的棕榈酰化修饰？通过生物信息学预测和点突变实验，研究人员将目标锁定在TEAD4蛋白的第367位半胱氨酸（人类为C367，小鼠为C360）。Click-iT实验显示，将C367突变为丝氨酸（C367S）后，TEAD4的棕榈酰化几乎完全消失。功能上，这一突变严重削弱了TEAD4结合CCL20启动子的能力（ChIP实验证实），并使其驱动CCL20转录（双荧光素酶报告基因实验）和表达（ELISA检测）的能力大幅下降。最终，表达TEAD4-C360S突变体的肾小管上皮细胞招募Th17细胞的能力也显著受损。这确定了C367是人类TEAD4功能最关键棕榈酰化位点。

脂肪酸合成酶（FASN）调控棕榈酸合成，为TEAD4棕榈酰化提供底物

棕榈酰化的底物棕榈酸从何而来？脂肪酸合成酶（FASN）是催化内源性棕榈酸合成的关键酶。对IgAN患者肾组织的单细胞测序数据以及BSA肾炎小鼠模型的分析均显示，FASN在受损的肾小管上皮细胞中高表达。功能实验表明，在肾小管上皮细胞中敲低FASN会减少TEAD4的棕榈酰化和CCL20的表达，从而削弱Th17细胞的迁移；而过表达FASN则产生相反的效果。更重要的是，外源性添加重组CCL20可以挽救FASN敲低导致的Th17细胞迁移缺陷，而CCL20中和抗体则可以逆转FASN过表达带来的促迁移效应。这证明了FASN通过提供棕榈酸底物，是TEAD4棕榈酰化及其下游信号通路的上游必要条件。

ZDHHC14是介导IgAN中TEAD4棕榈酰化的关键棕榈酰转移酶

是谁亲手将棕榈酸“安装”到TEAD4上？这需要特定的酶——棕榈酰转移酶（PAT）。研究人员对ZDHHC家族24个成员进行了筛查，发现Zdhhc14是唯一在BSA肾炎小鼠肾脏和炎症肾小管上皮细胞中均显著上调的成员。分子对接和Co-IP实验证实了ZDHHC14与TEAD4之间存在直接相互作用。更重要的是，在IgAN患者的肾组织中，ZDHHC14的表达也显著高于癌旁正常组织。功能上，敲低ZDHHC14会降低TEAD4的棕榈酰化水平，削弱其转录活性，减少CCL20表达；而过表达ZDHHC14则增强这一通路。研究人员还排除了其他一些有相关性的PATs（如ZDHHC1、ZDHHC21）的特异性作用，确认ZDHHC14是介导TEAD4棕榈酰化的关键酶。

FASN和ZDHHC14协同不可或缺地调控TEAD4棕榈酰化，驱动Th17细胞招募

FASN（提供底物）和ZDHHC14（催化反应）是否缺一不可？研究人员进行了交叉回补实验。结果表明，在FASN敲低的细胞中，即使过表达ZDHHC14也无法恢复TEAD4的棕榈酰化；反之，在ZDHHC14敲低的细胞中过表达FASN同样无效。这证明二者在功能上是相互依赖、不可或缺的。进一步的拯救实验表明，在敲低了TEAD4的肾小管上皮细胞中，过表达FASN或ZDHHC14均无法恢复CCL20的表达和Th17细胞的迁移。这清晰地表明，FASN和ZDHHC14的作用汇聚于TEAD4，TEAD4是该通路中不可替代的下游效应器。

棕榈酰转移酶抑制剂2-BP减轻Th17细胞浸润并延缓CKD进展

既然棕榈酰化是可逆的，那么干预它能否成为治疗策略？研究人员使用了广谱PAT抑制剂2-溴棕榈酸（2-BP）和APT抑制剂ML349进行验证。在细胞实验中，2-BP有效降低了TEAD4的棕榈酰化和CCL20的表达，而ML349则增强了这些效应。在动物实验中，从疾病第12周开始对BSA肾炎小鼠每周给予一次2-BP干预，持续至第24周。结果显示，与溶剂对照组相比，2-BP治疗显著改善了小鼠的肾功能（降低尿蛋白、血肌酐等），减轻了肾间质纤维化（α-SMA、Vimentin表达降低）和Th17细胞（ROR-γ⁺细胞）浸润。这为通过靶向棕榈酰化来治疗IgAN及其他Th17细胞驱动的疾病提供了概念验证。

综上所述，本研究首次揭示了一条由ZDHHC14介导的TEAD4棕榈酰化在肾脏免疫病理中的新通路。该通路阐明了肾小管上皮细胞在炎症损伤下，如何通过脂质代谢重编程（FASN上调）和蛋白质翻译后修饰（ZDHHC14催化TEAD4棕榈酰化）这一精细调控机制，放大炎症信号（CCL20表达），招募免疫细胞（Th17），最终驱动器官纤维化。这不仅深化了对IgAN疾病机制的理解，更重要的是，将蛋白棕榈酰化这一基础生化过程与肾脏疾病的免疫炎症核心联系起来，为开发针对ZDHHC14-TEAD4轴的新型疗法奠定了坚实的理论基础。尽管未来仍需在更大临床队列中验证并在特异性抑制剂开发上努力，但本研究无疑为治疗自身免疫性和纤维化肾脏疾病开辟了一个充满希望的新方向。