不同pH条件下粪肠球菌膜囊泡增强环境耐受性与巨噬细胞炎症反应的调控机制

《Journal of Bacteriology》：Effect of membrane vesicles produced under different pH conditions on the ability of Enterococcus faecalis to tolerate stressful environments and macrophages’ inflammatory response

本研究揭示了粪肠球菌（Enterococcus faecalis）在中性（pH 7.0）和碱性（pH 9.0）环境下产生的膜囊泡（MVs）如何增强细菌对极端环境（如高碱、高渗、营养匮乏和氯己定）的耐受性，并诱导巨噬细胞M1极化、活性氧（ROS）产生及转录组重编程，通过NOD样受体信号通路等多条炎症通路调控免疫反应，为理解持续性根尖周炎（PAP）的发病机制提供了新视角。

　　

粪肠球菌膜囊泡在不同pH条件下的产生与特性

粪肠球菌是一种革兰氏阳性细菌，常从根管治疗失败病例中分离出来，对高pH值、营养匮乏环境以及Ca(OH)₂、NaClO和氯己定（CHX）等根管治疗常用化学试剂表现出显著的耐受性。膜囊泡（MVs）是细菌在生理和病理条件下分泌的细胞外囊泡，与细菌的致病性、应激反应和宿主免疫调节相关。透射电子显微镜（TEM）显示，粪肠球菌在pH 7.0和9.0条件下均能产生典型的球形囊泡，具有脂质双分子层结构，直径约为100纳米。值得注意的是，碱性环境（pH 9.0）促进形成更小的囊泡。

膜囊泡增强粪肠球菌的环境应激耐受性

环境应激生存实验评估了粪肠球菌MVs对细菌在多种应激条件下生存能力的影响。在碱性应激（pH 10.0和11.0）下，添加pH 7.0和9.0的粪肠球菌MVs均能提高细菌的存活率。在高渗应激（4%和8% NaCl）下，pH 9.0的MVs在较高盐浓度下表现出更好的保护效果。在营养匮乏条件（10% TSB培养基）下，pH 9.0的MVs显著增强了细菌的生存能力，且效果呈浓度依赖性。在氯己定（CHX）挑战实验中，较低浓度的pH 7.0 MVs和较高浓度的pH 9.0 MVs均能提高粪肠球菌在短时间（1分钟）CHX暴露后的存活率，但延长暴露时间（3分钟）后所有组别均无法存活。

这种保护作用可能与MVs中携带的分子有关。早期的蛋白质组学和代谢组学分析发现，不同pH条件下的粪肠球菌MVs均表达分子伴侣蛋白DnaK和DnaJ，这些蛋白与细菌在应激环境下的稳定性有关。同时，MVs中还检测到甘氨酸甜菜碱和胆碱，这些化合物是微生物应对高渗环境的重要保护剂。特别是在碱性环境下产生的MVs，其应激蛋白（如RelA_SpoT结构域蛋白和Gls24通用应激蛋白）的表达上调，可能进一步增强了其在更极端环境下的保护能力。对于CHX的耐受性，推测较大的pH 7.0 MVs可能通过提供更大的表面积吸附CHX，减少CHX对细菌的粘附，从而起到保护作用。MVs中存在的SalB也与粪肠球菌的耐药性相关。

膜囊泡诱导巨噬细胞M1极化和活性氧（ROS）产生

为了研究粪肠球菌MVs对巨噬细胞免疫反应的影响，研究使用佛波酯（PMA）分化的人单核细胞系THP-1（dTHP-1）作为模型。流式细胞术分析显示，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，用pH 7.0或pH 9.0的粪肠球菌MVs处理dTHP-1细胞24小时后，M1型巨噬细胞标志物CD80⁺CD206^-细胞的比例显著增加，而M2型标志物CD206⁺CD80^-细胞的比例显著降低，表明两种pH条件下的MVs均能显著促进巨噬细胞向M1表型极化。值得注意的是，中性环境下产生的MVs诱导M1极化的能力显著强于碱性环境下产生的MVs。不同浓度MVs处理组之间巨噬细胞极化无显著差异，提示即使低浓度的MVs也能引发炎症反应。

研究进一步检测了巨噬细胞内活性氧（ROS）的水平。使用荧光探针DCFH-DA进行检测，荧光显微镜和流式细胞术结果均表明，pH 7.0和9.0的粪肠球菌MVs均能诱导巨噬细胞产生ROS，且这种诱导作用呈浓度依赖性。与极化结果类似，中性环境MVs刺激ROS产生的能力也强于碱性环境MVs。这表明粪肠球菌可以通过释放MVs诱导巨噬细胞产生活性氧，从而在根管治疗后的碱性环境中维持炎症，这可能与持续性根尖周炎的发生发展有关。

膜囊泡对巨噬细胞转录组的全局性影响

为了深入阐明粪肠球菌MVs调节巨噬细胞免疫反应的机制，研究对经MVs处理的巨噬细胞进行了RNA测序（RNA-seq）分析。与对照组相比，用pH 7.0粪肠球菌MVs处理的巨噬细胞鉴定出208个差异表达基因（DEGs），其中188个上调，20个下调。而用pH 9.0 MVs处理的巨噬细胞则鉴定出302个DEGs，其中260个上调，42个下调。这些差异表达基因显著富集于多种与炎症和免疫反应相关的通路。

基因本体（GO）分析显示，这些DEGs主要富集在生物过程，如细胞过程、生物调节、对刺激的反应、信号传导、代谢过程和免疫系统过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析进一步揭示，DEGs显著富集的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、Chemokine信号通路、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路等。此外，与骨吸收相关的通路，如破骨细胞分化，也被显著富集，尤其是在pH 9.0 MVs处理组中，破骨细胞分化相关基因（如CSF1, SQSTM1）的上调更为明显。

KEGG通路网络相互作用分析发现，细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、NOD样受体信号通路和Chemokine信号通路在网络中具有较多的节点连接，表明它们与其他差异表达基因和富集通路之间存在深刻的相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和关键驱动基因分析（KDA）鉴定出多个与免疫反应相关的关键驱动基因，如GBP1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, MX2, OAS1, RSAD2, USP18等。这些基因大多与干扰素刺激基因（ISGs）和NOD样受体信号通路相关。

NOD样受体信号通路和细胞焦亡的激活

基于KDA和RNA-seq结果，研究通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）验证了NOD样受体信号通路和细胞焦亡相关基因的表达。结果显示，与NOD样受体信号通路相关的TNF和GBP1基因在pH 7.0和9.0 MVs处理组中均显著上调。值得注意的是，NOD2基因仅在碱性环境MVs处理组中表现出显著上调。细胞焦亡相关基因CASP1和IL1B在两组中均显著上调，且pH 9.0 MVs的诱导作用更强。此外，NFKB1在碱性环境MVs处理组中也显著上调。这表明NOD样受体信号通路在巨噬细胞对粪肠球菌MVs（尤其是碱性环境下产生的MVs）的炎症反应中扮演重要角色，并且MVs能够诱导巨噬细胞发生细胞焦亡。

讨论与总结

持续性根尖周炎（PAP）是根管治疗后常见的口腔疾病，粪肠球菌在其中检出率很高。本研究系统探讨了粪肠球菌在不同pH环境下产生的MVs如何增强细菌自身对极端环境的适应性，并调控宿主巨噬细胞的免疫炎症反应。

研究发现，粪肠球菌MVs能够提升细菌在高碱、高渗、低营养和CHX环境下的存活能力，这与其携带的应激保护蛋白和相容性溶质密切相关。碱性环境可能诱导MVs产生更丰富的应激相关成分，从而在更苛刻的条件下提供保护。在宿主方面，粪肠球菌MVs，特别是中性环境下产生的MVs，强烈诱导巨噬细胞向促炎的M1表型极化，并刺激ROS产生。转录组学分析进一步证实，MVs通过激活复杂的细胞因子和趋化因子网络，以及NOD样受体信号通路等关键炎症通路，重编程巨噬细胞的免疫功能。尤其值得注意的是，碱性环境下的MVs对破骨细胞分化相关基因和NOD2介导的信号通路表现出更强的激活效应，暗示其在根尖周骨吸收中可能具有特殊意义。

综上所述，粪肠球菌通过释放MVs，不仅增强了其在根管治疗后恶劣环境中的生存能力，还主动调节宿主的免疫反应，倾向于促炎和骨吸收方向，这为阐明粪肠球菌在持续性根尖周炎中的持久性和致病性提供了新的机制见解。针对粪肠球菌MVs的干预策略可能为治疗难治性根尖周炎提供新的思路。未来的研究需要进一步探索MVs在体内的作用，并验证其作为治疗靶点的潜力。