万古霉素耐药屎肠球菌从定植到感染转变的纵向比较分析：基因组学与表型特征研究

《Microbiology Spectrum》：Comparative analysis of vancomycin-resistant enterococci in colonization and infection—a longitudinal study

本研究通过对54对配对VREfm（vancomycin-resistant Enterococcus faecium）分离株进行全基因组测序、生物被膜形成实验和点植法分析，发现定植株与血流感染株在基因型和表型特征上无显著差异。81%的配对分离株显示高度遗传相关性，表明感染主要由初始定植菌株直接引起。研究强调宿主-病原体相互作用在VREfm血流感染发展中的关键作用，为预防高危患者感染提供了重要依据。

　　

ABSTRACT

万古霉素耐药屎肠球菌（VREfm）在胃肠道的携带是发生侵袭性感染的危险因素。从定植到感染的转变机制尚不清楚。我们进行了一项纵向研究，纳入54对VREfm分离株，包括来自同一患者的定植分离株和随后的血流感染分离株。我们进行了全基因组测序、生物被膜形成实验和点植法实验，以研究分离株的基因型和表型特征。在配对定植和感染分离株之间未检测到这些特征的显著差异。基因分型显示，在27对分离株中有22对（81%）的定植分离株与其相应的感染分离株遗传密切相关。需要进一步研究关注宿主上皮和病原体之间的相互作用，以更深入了解从定植到感染的转变。

IMPORTANCE

先前的研究主要关注与万古霉素耐药屎肠球菌（VREfm）感染发展相关的患者相关危险因素。然而，识别和表征导致这种转变的细菌因素至关重要，特别是考虑到VREfm感染的治疗选择有限。我们的分析显示定植和感染分离株之间没有显著差异，表明宿主-病原体相互作用可能在这一进程中扮演更关键的角色，应进一步研究。此外，我们的发现强调了风险评估和感染预防措施对于预防VREfm定植的重要性，这是VREfm感染发展的关键步骤。

INTRODUCTION

肠球菌是人类正常肠道微生物群的一部分。然而，这些病原体可引起严重感染，如血流感染（BSI），尤其是在危重或免疫功能低下患者中。特别是，获得性万古霉素耐药的屎肠球菌（vancomycin-resistant E. faecium, VREfm）在感染发生时阻碍了成功和有针对性的抗生素治疗。在大多数患者中，VREfm感染之前存在定植。定植的危险因素包括抗生素治疗、频繁接触医疗保健、长期住院、免疫抑制和入住重症监护室。VREfm感染的危险因素包括先前VREfm定植、异基因骨髓移植、中性粒细胞减少症或中心静脉导管置入。虽然这些宿主相关危险因素已得到充分研究，但可能触发定植宿主发生VREfm感染的病原体相关因素在很大程度上是未知的。Chilambi等人在一项回顾性队列研究中调查了免疫功能低下儿科患者肠道定植和BSI期间VREfm的基因组和表型变化，并确定了影响细菌生长和生物被膜形成的突变对感染发展至关重要。最近，细菌素（bacteriocins）被确定在肠球菌的种间和种内相互作用中发挥重要作用。迄今为止，关于源自成人的定植和感染VREfm的基因型和表型差异的数据很少。本回顾性队列研究旨在识别定植和感染分离株的差异及其相互作用，以理解导致人类感染的转变过程。

RESULTS

Patient cohort

本研究包括来自德国一家三级医院的27名患者队列，这些患者最初定植VREfm，随后发展为VREfm BSI。该队列包括20名男性（74%）和7名女性（26%）患者，年龄范围23至81岁（中位年龄=60岁）。直肠定植与VREfm BSI发病之间的间隔时间在5至1,836天之间（平均=313天）。大多数患者被诊断患有肿瘤疾病（n = 20; 74%），其中血液肿瘤最为普遍（n = 16; 59%）。其余患者（n = 7; 26%）被诊断患有其他基础疾病（包括丙型肝炎[n = 2; 7%]、胰腺炎[n = 2; 7%]和周围动脉疾病[n = 1; 4%]）。四名患者（18%）在血培养检测到VREfm后14天内死亡，我们将其定义为BSI相关死亡。关于患者结局和毒力因子存在与否，在生物被膜形成或细菌素产生方面未检测到显著差异。关于检测到的毒力因子与BSI相关死亡率的关联的进一步信息见表2。

Molecular characteristics of VREfm isolate

本研究共调查了54株临床分离株，于2015年至2023年间从27名患者获得。基因组测序显示所有分离株均存在vanB基因。多位点序列分型（MLST）鉴定出四种不同的序列型（ST），即ST117（n = 27）、ST80（n = 23）、ST2542（n = 2）和ST2032（n = 2）。所有ST都属于克隆复合体17（clonal complex 17）。在五名患者中，定植分离株的ST与侵袭性分离株不同（对11、15、23、26、27）。基于核心基因组多位点序列分型（cgMLST）的最小生成树显示了分离株的等位基因距离。一些分离株在cgMLST分析中没有显示任何差异。

对推定毒力标记物（PVMs）的全面分析显示定植和感染分离株之间没有差异。所有分离株都携带参与粘附（例如empA-empC、sgrA、ecbA、fms11、fms13、fms14）、生物被膜形成和定植（hylE和sagA）的基因。参与碳水化合物代谢、细胞生长（例如ccpA、orf1481）和磷酸转移酶系统（例如ptsD、bepA）的基因也在所有分离株中发现。与上述结果相反，scm仅存在于大约一半的定植和一半的感染分离株中。Scm（第二种胶原蛋白粘附素）在粘附中起作用，并结合V型胶原蛋白和纤维蛋白原。

细菌素筛选在我们的分离株中鉴定出四种不同的细菌素编码基因：bac43、entA、bac51和bac32。其中，entA存在于大多数分离株中（98%），其次是bac43（94%）、bac51（39%）和bac32（1%）。在配对定植和感染分离株中，未发现细菌素编码基因的差异。在所有编码bac51的分离株中，85.7%属于ST80/CT1065。

Interaction between colonization and infection isolates

在点植法实验中，当感染分离株点种在相应的定植分离株上时，未显示任何生长抑制。相反，两个定植分离株抑制了其相应感染分离株的生长。在这两种情况下（对23和26），定植分离株和感染分离株属于不同的ST（ST117/CT71 vs ST80/CT1065）。此外，所有分离株都点种在属于ST18的分离株上作为内部对照。三个分离株未抑制历史ST18的生长（18a, 18b, 26b）。

Biofilm formation

所有分离株的生物被膜形成能力在3个不同的日子用9个重复进行测量（总共27个重复）。观察到在96孔板中形成生物被膜的整体能力有限。定植（标准化OD₅₉₅比值0.386）和感染（标准化OD₅₉₅比值0.370）分离株在生物被膜形成方面没有差异（P = 0.77）。然而，三个定植分离株（1a, 5a, 15a）和两个感染分离株（12b, 25b）显示出相对较强的生物被膜形成能力。这些菌株表现出与其余分离株观察到的典型生物被膜形成模式的偏差，表明它们产生生物被膜的能力存在潜在变异。

DISCUSSION

定植VREfm的个体发生后续VREfm感染的风险增加。在本研究中，我们旨在阐明引发从定植向感染转变的分离株的致病因素。我们表征了54对配对定植和侵袭性VREfm分离株，发现配对定植和侵袭性分离株之间没有显著的遗传和表型差异。这凸显了需要进一步研究宿主因素在BSI发展中的作用。

本研究包括27对来自德国三级医疗机构的VREfm配对患者，这些患者最初定植VREfm，随后发展为VREfm BSI。队列中的大多数患者被诊断患有肿瘤疾病，特别是血液肿瘤，这先前已被描述为发生VREfm感染的主要危险因素。纳入患者的性别和年龄分布与先前的荟萃分析一致，显示VREfm BSI在男性中患病率更高。关于ST分布，ST117和ST80被确定为我们分离株收集中的主要ST，所有菌株均为vanB阳性。这一结果与德国国家葡萄球菌和肠球菌参考中心（NRC）的数据一致，该中心在2016年记录了从vanA向vanB的转变。此外，来自NRC和其他研究的数据证实了上述ST不仅在德国而且在世界范围内的主导地位。这些ST也与较高的VREfm BSI发生率相关，解释了这些ST在我们队列中的发生率。

近年来，在屎肠球菌中鉴定出几种推定毒力标记物（PVMs）。先前的研究显示医院适应的屎肠球菌菌株中PVMs富集，表明在医院环境中具有生存优势。我们观察到定植和感染分离株之间在PVMs的数量或类型上没有差异，因此得出结论VREfm在定植期间不会获得PVMs。

除了对分离株进行基因组分析外，我们还研究了它们形成生物被膜的能力。我们的分离株仅产生弱生物被膜，这与先前研究的结果一致。然而，Stege等人使用RNAseq在转录水平上观察到，当VREfm与人源结肠上皮共培养时，与生物被膜和菌毛形成相关的基因上调。这些发现强调了在宿主-病原体相互作用的背景下进一步研究病原体特异性因素的重要性。

在点植法实验中，观察到定植和感染菌株的共存。尽管感染分离株未显示对定植分离株生长的直接抑制作用，但细菌素介导的种间竞争可能仍然是促成感染过程的重要因素。Ubeda等人在动物模型中显示，VREfm在胃肠道中的过度生长导致感染。因此，细菌素可能有助于在肠道中主导其他细菌物种，从而导致后续感染。在我们的分离株收集中，我们确定肠球菌素A（enterocin A）和细菌素43（bacteriocin 43）是最普遍的细菌素。虽然我们的大多数分离株抑制了历史ST18 VREfm的生长，但那些不携带bac43的分离株（18a, 18b, 26b）没有抑制ST18 VREfm的生长。这些结果证实了早期的发现，即细菌素43，也称为细菌素T8，是ST117和ST80全球主导地位的主要驱动因素。在两个案例中（对23和26），当定植分离株（ST117）抑制其相应感染分离株（ST117）的生长时，分离株属于不同的ST。在对26中，观察到的生长抑制可以通过感染分离株（26b）中缺乏bac43来解释。在对23中，bac43在定植和感染分离株中均被检测到。这一观察结果提出了一个问题，即除了细菌素43之外，是否还有另一个因素在生长抑制中很重要。

尽管本研究有优势，但有几个局限性需要承认。由于只研究了首次定植和首次BSI VREfm分离株，当前研究的信息可能有限。此外，VREfm定植首次检测与感染发展之间的时间点变化很大。尽管如此，在直肠检测到感染发病之间的间隔期内，配对分离株未显示表型或基因型变异，表明宿主内进化不是VREfm BSI发展的关键因素。

总之，我们的研究仅在基因型和表型水平上揭示了定植和感染分离株之间的微小差异。这表明最初定植患者的克隆随后引起感染，而无需在定植期间获得毒力。因此，应研究其他因素，如肠道屏障以及宿主和病原体的相互作用，以阐明VREfm从定植到BSI的转变。肿瘤学和血液肿瘤学患者经常接受化疗，导致屏障破坏，这一事实突显了研究VREfm如何穿越胃肠道屏障的重要性。我们还建议应实施感染预防措施，以预防高危患者的VREfm定植，同时最大限度地降低发生感染的风险。此外，在缺乏去定植策略的情况下，应引入风险评估以帮助识别有发生VREfm BSI风险的患者。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strain collection

本研究中纳入了54对配对VREfm分离株，于2015年至2023年间在德国一家三级医院获得。一对包括来自同一患者的直肠分离株和随后的BSI分离株。

Study design

拥有1,438张床位的维尔茨堡大学医院是一家三级医疗中心，每年收治约60,000名患者。根据国家指南，在定义的高风险病房（即血液肿瘤科、中级监护病房和重症监护室）进行每周和入院VREfm筛查。如果在筛查期间检测到VRE，则继续进行基本卫生措施，而在单个病例中不实施接触预防或隔离策略。在流行病学相关的聚集性情况下，实施疫情管理和综合策略，包括加强表面消毒、接触预防和患者隔离。

Microbiological culturing, antibiotic susceptibility testing

直肠拭子或阳性血培养物接种在血琼脂平板上，并在36°C下培养24小时。通过VitekMS进行物种鉴别。使用Vitek2或通过琼脂梯度扩散进行的药敏试验根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）的折点进行解释。

Whole-genome sequencing-based typing and virulence factor analysis

分离的VREfm使用Illumina NextSeq 2000平台进行全基因组测序。使用Velvet进行从头组装后，使用SeqSphere⁺软件版本10.0.5，使用先前发布的屎肠球菌cgMLST靶标方案，通过基因逐个基因的方法比较编码区。使用相同软件对测序菌株进行单核苷酸变异（SNV）分析。为了显示基因型的遗传关系，应用了最小生成树算法，而差异在三个或更少cgMLST靶基因的分离株被定义为密切相关。MLST STs以及cgMLST复合类型（CTs）从全基因组测序数据中计算机提取。使用基因组流行病学中心（Center for Genomic Epidemiology）的VirulenceFinder以选定的>98%阈值识别PVMs。为了筛选细菌素编码基因，在CGE MyDbFinder中使用了最近发布的数据库，选定的阈值>80%和>60%覆盖率。

Biofilm formation assay

使用先前描述的半定量实验评估临床分离株在非生物表面形成生物被膜的能力。简而言之，准备VREfm在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中的过夜培养物，将OD₆₀₀调整至0.35，随后用TSB稀释1:10。将这些悬浮液以200 μL的最终体积加载到96孔板中，并在36°C静态条件下孵育48小时。弃去上清液，用200 μL PBS洗涤板三次。板在56°C热固定1小时，并用1%结晶紫染色5分钟。染色后，用去离子水冲洗板，干燥，结晶紫溶解在200 μL 20:80丙酮/乙醇混合物中。用分光光度法测量OD₅₉₅。粪肠球菌ATCC 29212用作阳性对照。

Spot-on-lawn assay

为了更好地理解定植和感染分离株之间的相互作用，进行了点植法实验。将脑心浸液（BHI）中定植分离株的过夜培养物调整至OD₆₀₀ = 0.05。将100微升先前制备的悬浮液加入5 mL液化的0.7% BHI琼脂中，混合并倒在1.5% BHI琼脂上。将5微升相应感染分离株的过夜培养物点种在菌苔上，反之亦然。然后将平板在36°C孵育18-24小时。如果抑制圈>1 mm，则认为样本阳性。使用历史VREfm（MLST ST18）作为对照菌株。

Computational and statistical analysis

对于生物被膜形成实验，在每个测量日，三个96孔板相同制备，包括三个技术重复，以及阴性（空白）和阳性对照。生物被膜形成的OD₅₉₅测量值按样本平均，并减去平均阴性对照（空白）值。将所得值除以平均阳性对照值进行归一化，以控制生物被膜形成的每日变异。最后，每个样本的归一化OD₅₉₅比值在孔板间平均。对每个测量日进行此操作，所得三个OD₅₉₅测量值再次在测量日间平均。使用R Studio（R版本4.4.2）进行配对双尾t检验以检验统计学显著性。对于毒力因子与临床结局的关联分析，进行Fisher精确检验。假定P < 0.05为统计学显著。

ACKNOWLEDGMENTS

我们感谢维尔茨堡大学卫生与微生物学研究所的团队，特别是Alexandra Prappacher，提供的出色技术支持。

该项目由S.K.构思。S.K.开发了方法学。V.B.、V.R.和H.C.进行了调查研究。V.B.、V.R.、H.C.和S.K.为数据分析和解释做出了贡献。初稿由V.B.和V.R.撰写，并由S.K.修订。S.K.提供了所需资源。监督和项目管理由S.K.执行。所有作者审阅并批准了最终版本的手稿。