基于浮萍共培养技术从水体中分离的Opitutaceae科潜在新属菌株MRC-7的全基因组解析及其果胶降解潜能

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of a member of a potentially novel genus within the family Opitutaceae isolated from a liquid medium used for co-cultivating duckweeds and river water-derived microbes

本研究报道了采用浮萍-微生物共培养技术从河水环境中分离得到一株隶属于Opitutaceae科的潜在新属菌株MRC-7，并完成了其高质量全基因组测序（4.34 Mb，GC含量65.2%）。基因组注释揭示了大量与果胶降解相关的糖苷水解酶（GHs）和多糖裂解酶（PLs），为阐释该难培养细菌在水生植物微生态系统中的营养代谢功能提供了重要遗传基础。

　　

ABSTRACT

研究人员报道了菌株MRC-7的完整基因组序列，该菌株代表了Opitutaceae科内的一个潜在新属。基因组大小为4,342,534 bp，包含3,428个蛋白质编码序列，其中一些被预测参与果胶降解过程。

ANNOUNCEMENT

水生植物已知蕴藏着分类学上多样化的微生物，包括难以培养的类群。基于此背景，研究团队开发了名为“浮萍-微生物共培养法”的微生物分离技术，该方法对于分离稀有细菌类群非常有效。利用此方法，他们成功分离出了菌株MRC-7，该菌株属于难以培养的Opitutaceae科细菌。

具体的分离流程如下：首先，为了制备无菌浮萍，将浮萍的休眠芽用0.5%次氯酸钠清洗5分钟，然后用无菌水冲洗两次。处理后的休眠芽移植到改良的Hoagland培养基中进行萌发，萌发后的浮萍用作无菌浮萍。以2021年8月30日采集的河水作为微生物来源，接种到无菌浮萍中。共培养在改良的Hoagland培养基中进行，持续10天。将共培养后的液体培养基接种到1/100浓度的胰蛋白胨大豆琼脂平板上，于25°C培养2周，最终从中分离出菌株MRC-7。

由于Opitutaceae科的成员分布广泛但难以培养，对其成员进行基因组分析对于阐明它们在生态系统中的作用具有重要价值。因此，研究人员报告了菌株MRC-7的基因组序列。菌株的基因组DNA是从在R2A肉汤中培养7天的培养物中提取的。基因组DNA使用g-TUBE设备剪切至约10–20 kbp。文库使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0制备，并在Sequel IIe系统上进行测序。使用SMRT Link软件去除接头序列以准备亚读数。通过比对亚读数并排除平均质量值<20的读数，获得HiFi reads。使用Filtlong过滤掉长度≤1,000 bp的读数，最终使用15,572条读数进行组装。基因组组装使用Flye完成，并利用Bandage确认了基因组的环状结构。使用GTDB-Tk的“classify_wf”命令确认其系统发育位置，并使用iTOL进行可视化。平均氨基酸一致性使用FastAAI计算。使用CheckM评估基因组的完整性和污染情况，结果显示完整度为100%，污染率为0%。编码序列使用DFAST进行注释，并通过GhostKOALA与KEGG数据库进行比对。碳水化合物活性酶使用dbCAN3服务器进行注释。

基于120个细菌标记蛋白串联构建的系统发育树确认MRC-7属于Opitutaceae科。该菌株与Rariglobus hedericola的亲缘关系最近，但平均氨基酸一致性仅为57.08%，表明它代表了Opitutaceae科内一个潜在的新属。基因组由一个大小为4,342,534 bp的染色体组成，GC含量为65.2%。DFAST注释显示该染色体包含3,428个CDS、49个tRNA基因和3个rRNA基因。KEGG直系同源基因的数量为1,416个。多个CDS被注释为糖苷水解酶和多糖裂解酶，这些酶均参与果胶降解过程。

由于菌株MRC-7是从浮萍共培养系统中分离得到的，该环境可能含有浮萍生长过程中释放的植物细胞壁碎片。由于植物细胞壁含有多种类型的果胶，检测到的这些酶可能使MRC-7能够利用来自浮萍的果胶。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到了日本学术振兴会科研费、日本科学技术振兴机构/日本国际协力机构、可持续发展科学技术研究伙伴计划以及大阪发酵研究所研究经费的资助。

DATA AVAILABILITY

Opitutaceae科细菌菌株MRC-7的完整基因组序列已存入日本DNA数据库，登录号为AP038926。通过dbCAN3服务器、KEGG数据库和FastAAI注释的数据已存入Figshare平台。