负载锰氧化物纳米酶和CO释放分子的埃洛石纳米管通过重塑结肠免疫-微生物群-屏障稳态并缓解疼痛治疗溃疡性结肠炎

《Bioactive Materials》：Manganese oxide nanozyme-loaded CO-releasing halloysite nanotubes for remodeling colonic immune, microbiota, and intestinal barrier homeostasis with concurrent pain relief in ulcerative colitis

本研究针对溃疡性结肠炎(UC)治疗中存在的免疫失调、屏障功能障碍和菌群失调等难题，开发了一种新型工程化纳米酶CMHs（CO&MnOx@Hs）。该纳米酶通过整合锰氧化物(MnOx)的活性氧(ROS)清除能力和一氧化碳(CO)释放分子CORM-401的抗炎作用，实现了在炎症部位的靶向积累和协同治疗。研究证实CMHs能有效重塑结肠免疫稳态、修复肠道屏障、调节肠道微生物群并缓解炎症相关疼痛，为UC提供了多靶点、高效且安全的治疗新策略。

　　

溃疡性结肠炎(UC)是一种困扰全球数百万患者的慢性炎症性肠病(IBD)，其特征是结肠黏膜的反复发作的炎症、溃疡和功能紊乱。患者常常遭受腹痛、腹泻、便血等症状的折磨，严重影响生活质量。更棘手的是，UC的发病机制复杂，涉及免疫系统异常激活、肠道屏障功能受损以及肠道微生物群（即肠道菌群）失调等多个环节，它们相互影响，形成恶性循环，导致疾病迁延不愈。目前，UC的临床治疗主要依赖氨基水杨酸类药物、皮质类固醇、免疫抑制剂以及生物制剂等。然而，这些疗法往往存在局限性：长期使用可能带来肝毒性、免疫抑制、增加感染风险等副作用，且对部分患者疗效有限，难以从根本上逆转疾病的病理过程。因此，开发能够同时针对UC多个核心病理环节、且安全性高的新型疗法，成为当前科研和临床实践中的迫切需求和巨大挑战。

在这一背景下，气体疗法和纳米酶技术为UC治疗带来了新的希望。一氧化碳(CO)作为一种内源性气体信号分子，被发现具有抗炎、抗氧化、细胞保护等多种有益的生物活性。然而，如何将这种气体安全、可控地递送到结肠炎症部位，并使其在需要的时间和地点精准释放，是一个巨大的技术难题。另一方面，纳米酶是一类具有类似天然酶催化活性的纳米材料，其中锰氧化物(MnOx)纳米酶因其具备超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)样的双重抗氧化活性，尤其在UC病灶的酸性微环境中活性增强，显示出强大的清除活性氧(ROS)的潜力。但单一的MnOx纳米酶其抗炎效果相对有限。能否将CO气体疗法的强大抗炎作用与MnOx纳米酶的高效抗氧化能力结合起来，实现“1+1>2”的协同治疗效果，是研究人员关注的焦点。此外，还需要一个理想的“运载工具”能将这两种治疗成分精准地送达结肠炎症部位。天然矿物埃洛石纳米管(Hs)因其良好的生物相容性、独特的中空管状结构（利于装载药物）以及表面电荷特性（易于在带正电的炎症黏膜处富集），被视为极具潜力的结肠靶向给药载体。

为了解决上述问题，并探索UC的创新疗法，温州医科大学的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项研究，他们成功构建了一种名为CMHs的工程化纳米酶。该研究综合利用了纳米材料合成技术（包括埃洛石纳米管的氨基功能化、高锰酸钾原位还原生成MnOx、以及CORM-401的封装）、多种体外细胞模型（如巨噬细胞、肠上皮细胞、神经元与胶质细胞共培养模型）和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，系统评估了CMHs的理化性质、生物相容性、靶向性、抗氧化、抗炎、屏障修复、菌群调节及镇痛效果，并深入探讨了其作用机制，涉及RNA测序(RNA-seq)、蛋白质印迹(WB)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)、16S rRNA基因测序等多种分子生物学技术。

2.1. CMHs的合成与表征

研究人员首先对天然埃洛石纳米管(Hs)进行氨基化修饰，得到NHs。随后，通过光还原法在NHs表面原位生长锰氧化物(MnOx)，形成MHs。最后，将CO释放分子CORM-401封装进MHs的纳米管腔中，最终得到目标产物CMHs。表征结果显示，CMHs具有合适的纳米尺寸（约668 nm）和负电性（Zeta电位约-42.0 mV），这有利于其通过静电作用靶向积累于带正电的炎症结肠黏膜。CMHs中的MnOx主要以Mn3?和Mn??形式存在，赋予了其优异的催化活性。体外实验证实，CMHs能有效清除超氧阴离子(O?·?)、过氧化氢(H?O?)、羟基自由基(·OH)等多种ROS，且其清除效率优于单独的MHs。更重要的是，CMHs中CORM-401的CO释放具有ROS响应性，即在H?O?存在的条件下，CO释放量显著增加，实现了“按需”释放。CMHs在模拟结肠液(SCF)和PBS中均表现出良好的稳定性。

2.2. CMHs的抗氧化和抗炎作用及机制

细胞实验表明，CMHs具有良好的生物相容性。在脂多糖(LPS)诱导的活化巨噬细胞（模拟炎症环境）中，CMHs能被细胞摄取，并有效释放CO，同时显著降低细胞内ROS、活性氮物种(RNS)和H?O?的水平。CMHs处理还能显著上调细胞内抗氧化酶（如SOD、CAT、GPX、HO-1）的活性。其抗氧化机制与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。在抗炎方面，CMHs能诱导巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型极化，表现为细胞形态改变（从多伪足状变为长梭形），以及M1标志物（iNOS、TNF-α、IL-1β）表达下调，M2标志物（CD206、IL-10、Arg-1）表达上调。RNA-seq和机制研究表明，CMHs通过激活PI3K-Akt通路、抑制HIF-1α/LDHA通路及其下游的NF-κB和TNF信号通路，从而发挥抗炎作用和促进M2极化。

2.3. CMHs的肠道屏障修复作用及机制

利用H?O?诱导的Caco-2肠上皮细胞氧化损伤模型，研究人员评估了CMHs对肠道屏障的保护和修复作用。结果表明，CMHs能显著减轻H?O?引起的细胞凋亡，促进细胞增殖和迁移，并上调紧密连接蛋白（如ZO-1、Occludin、Claudin-1）的表达，从而增强肠道屏障的完整性。RNA-seq分析提示，CMHs的屏障修复作用可能通过抑制细菌侵袭上皮细胞通路和ROS信号通路，同时激活黏着斑、ECM-受体相互作用和PPAR信号通路来实现。此外，CMHs还能清除线粒体ROS，保护线粒体功能。

2.4. CMHs在DSS诱导的UC小鼠模型中的治疗效果

在DSS诱导的小鼠UC模型中，经直肠给予CMHs后，活体成像显示CMHs能选择性地在结肠炎症部位富集并滞留较长时间。CMHs治疗能显著改善UC小鼠的疾病症状，包括阻止体重下降、降低疾病活动指数(DAI)、减轻结肠缩短和脾脏肿大、降低髓过氧化物酶(MPO)活性（反映中性粒细胞浸润减少），并显著改善结肠组织的病理损伤。CMHs的治疗效果优于传统的5-ASA药物和游离的CORM-401。安全性评估表明，CMHs治疗未引起明显的全身毒性、肝肾功能损伤或锰离子在主要器官的蓄积。

2.5. 体内结肠免疫反应和肠道屏障完整性的重塑

在体实验进一步验证了CMHs的体内功效。CMHs治疗能有效清除结肠组织中的ROS，提升抗氧化酶活性，促进巨噬细胞向M2表型极化，降低促炎因子（IL-6、TNF-α）水平，提高抗炎因子（IL-4、IL-10）水平。同时，CMHs能显著降低肠道通透性（通过FITC-葡聚糖渗漏实验评估），并上调结肠组织中紧密连接蛋白的表达，证实其强大的屏障修复功能。

2.6. 体内肠道微生物群组成和功能的调节

通过对小鼠粪便进行16S rRNA测序分析，发现DSS诱导的UC导致肠道菌群多样性显著降低，菌群结构失调。而CMHs治疗能有效重塑肠道微生物群，使其组成更接近健康对照组。具体表现为：CMHs降低了与UC相关的致病菌（如肠杆菌科A、变形菌门）的丰度，增加了有益菌（如厚壁菌门D、拟杆菌科、乳酸菌科、Muribaculaceae）的丰度。功能预测分析表明，CMHs还能恢复菌群中短链脂肪酸（如丁酸）合成等相关代谢通路，有助于改善肠道微环境。

2.7. 体内慢性炎症相关疼痛的缓解

疼痛是UC患者常见的痛苦症状。本研究首次深入探讨了CMHs的镇痛效果。行为学观察发现，CMHs治疗能改善UC小鼠因疼痛导致的饮水和摄食减少。腹部撤回反射(AWR)实验表明，CMHs能显著降低UC小鼠的内脏痛觉敏感性。对结肠组织进行RNA-seq分析发现，CMHs治疗后，与神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、谷氨酸能突触、cGMP-PKG信号通路等疼痛相关通路被显著下调。免疫荧光染色显示，CMHs能抑制结肠组织中疼痛相关受体TACR1和TRPV1的表达。体外神经元与胶质细胞共培养模型进一步证实，CMHs可通过减轻炎症因子对神经元的损伤、抑制P物质(SP)的分泌和TACR1的表达、进而抑制TRPV1通道的激活和钙离子(Ca2?)内流，从而发挥镇痛作用。

该研究成功开发了一种集MnOx纳米酶抗氧化能力和CO气体疗法抗炎作用于一体的新型工程化纳米酶CMHs，用于溃疡性结肠炎的协同治疗。CMHs能靶向炎症结肠，通过多重机制发挥治疗作用：清除ROS并激活Nrf2/HO-1通路增强抗氧化防御；调节PI3K-Akt、HIF-1α/LDHA、NF-κB和TNF信号通路，促进巨噬细胞M2极化，抑制炎症；通过保护肠上皮细胞、促进紧密连接蛋白表达和激活相关修复通路来修复肠道屏障；重塑肠道微生物群，恢复菌群平衡；并通过调节疼痛信号通路和受体有效缓解UC相关疼痛。这项研究不仅提出了一种极具临床应用前景的UC多靶点治疗新策略，而且深入揭示了其分子和细胞水平的作用机制，为纳米酶与气体疗法结合治疗炎症性肠病提供了重要的理论和实验依据。