海藻提取与分离技术：用于鉴定具有潜在抑制奶牛甲烷产生能力的生物活性化合物的策略

《Algal Research》：Seaweed extraction and fractionation as a strategy to identify bioactive compounds with potential methane inhibition in dairy cows

本研究通过溶剂极性不同的浸取和固相萃取技术，从三种北欧常见海藻（D. dichotoma、S. muticum、D. sanguinea）中提取活性成分，并利用体外瘤胃发酵模拟系统评估其抗甲烷活性。结果显示，D. dichotoma的高极性提取物（乙醚醋酸酯和庚烷）显著降低甲烷产量（减少30-35%），同时通过促进丙酸生成抑制甲烷菌活性。代谢组学分析表明，D. dichotoma富含萜类化合物（如脂肪酸乙酰胺、伊波帕酯、视黄烯等），而S. muticum以硫脂酸为主，D. sanguinea含酚硫酯类。研究证实靶向提取可富集抗甲烷活性成分，但需平衡对饲料降解和动物营养的影响。

　　这项研究探讨了从三种海藻——Dictyota dichotoma、Sargassum muticum 和 Delesseria sanguinea 中提取的生物活性化合物对反刍动物瘤胃发酵中甲烷生成的抑制潜力。研究采用了不同极性的溶剂进行浸泡提取，并在模拟瘤胃发酵的体外系统中测试了这些提取物和其部分分级产物的生物活性。研究结果表明，某些海藻提取物，特别是具有高度脂溶性的提取物，能够显著减少甲烷产量，但同时也会对发酵过程中的挥发性脂肪酸（VFA）和干物质降解（DMD）产生负面影响。研究还揭示了不同海藻种类在代谢物谱上存在显著差异，其中 Dictyota dichotoma 的提取物含有较多的前醇类脂质，包括可能的二萜类化合物和视黄醇类物质；而 Sargassum muticum 的提取物则富含硫酸化中链脂肪酸及其他硫酸化化合物；Delesseria sanguinea 的提取物则显示出结构多样的代谢物，可能成为筛选非卤素甲烷抑制剂的候选。

研究背景指出，海藻在食品、饲料添加剂以及生物精炼厂原料方面具有广泛应用，因此在蓝经济的概念中扮演着重要角色。近年来，由于发现了 Asparagopsis taxiformis 的抗甲烷活性以及卤代甲烷（如溴仿和溴氯甲烷）作为主要生物活性物质，海藻在减少反刍动物甲烷排放方面受到越来越多的关注。此外，其他海藻种类如 Bonnemaisonia hamifera 和某些褐藻，例如 Dictyota bartareysii 和 Sargassum flavicans，也显示出抗甲烷特性。然而，这些研究中观察到的甲烷减少程度与使用的剂量和模拟瘤胃发酵的底物有关。已有研究显示，来自褐藻的酚类化合物（如 phlorotannins）在体外实验中具有抗甲烷活性，但当使用未处理的完整褐藻时，这种活性并未显现，这表明需要从海藻中提取并浓缩这些生物活性物质才能有效抑制甲烷生成。

研究方法部分详细描述了提取和分级的步骤。首先，使用不同极性的溶剂（75% 甲醇、乙酸乙酯和庚烷）对粉碎的海藻样品进行浸泡提取。其中，75% 甲醇提取物进一步通过固相萃取（SPE-C18）进行分级，以获得不同浓度的乙腈（ACN）提取物。这些提取物和分级产物被重新配制为二甲基亚砜（DMSO）溶液，并在体外瘤胃发酵系统中进行测试，使用玉米青贮作为标准底物。研究通过测量总气体（TGP）和甲烷（CH?）产量（分别在24小时和48小时进行），以及在48小时评估挥发性脂肪酸（VFA）和干物质降解（DMD）来分析这些提取物的抗甲烷活性。此外，使用液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）对提取物和分级产物进行非靶向代谢组学分析，以识别潜在的生物活性代谢物。

研究结果表明，使用高脂溶性提取物（乙酸乙酯和庚烷）的 Dictyota dichotoma 在48小时时显著减少了总气体产量（TGP），与对照组相比减少了约115–123 mL/g DM（对照组为157 mL/g DM），且在24小时时也观察到较低的甲烷产量（6.34–7.14 mL/g DM，对照组为9.83 mL/g DM）。然而，总VFA产量和DMD均显著降低。这一现象表明，使用高脂溶性提取物可能对甲烷生成菌产生了特异性抑制，但同时也对发酵过程中的微生物活动产生了负面影响。相比之下，未分级的甲醇提取物并未表现出抗甲烷效果，但Dictyota dichotoma 的65% ACN 分级产物在TGP方面显示出一定的减少趋势，这突显了靶向提取和分级的重要性。研究还指出，Dictyota dichotoma 中的生物活性化合物可能在减少反刍动物甲烷排放方面具有潜力，但需要进一步的分级和纯化以区分甲烷生成菌的抑制作用与其他可能的不良影响。

讨论部分强调了提取和分级策略的重要性，这些策略能够分离出具有特定生物活性的化合物，并将它们与其他可能产生相反或无影响的化合物区分开来。例如，使用不同极性的溶剂可以提取不同类型的化合物，如高脂溶性的乙酸乙酯和庚烷能够有效提取Dictyota dichotoma 中的二萜类化合物和前醇类脂质，这些化合物可能对甲烷生成菌具有特异性抑制作用。然而，这些高脂溶性提取物同时减少了饲料的干物质降解和总VFA产量，这可能影响宿主动物的营养吸收。因此，尽管Dictyota dichotoma 的高脂溶性提取物在减少甲烷方面效果显著，但其对饲料发酵的负面影响也需要进一步研究。

研究还指出，Sargassum muticum 的提取物富含硫酸化中链脂肪酸，这些化合物可能在抑制甲烷生成方面具有潜力。而Delesseria sanguinea 的提取物虽然含有结构多样的代谢物，但未检测到显著的甲烷减少效果，这可能与其不含卤代甲烷有关。研究进一步强调，虽然三种海藻都含有生物活性代谢物，但只有Dictyota dichotoma 的高脂溶性提取物能够显著减少甲烷并同时增加丙酸的比例，这表明这些化合物可能具有特定的抗甲烷活性。然而，这种活性可能伴随着对微生物发酵过程的负面影响，因此需要进一步研究以确定这些化合物是否可以作为有效的抗甲烷剂，同时不会对饲料发酵产生不利影响。

结论部分指出，该研究证实了Dictyota dichotoma 中的高脂溶性化合物在减少甲烷排放方面具有潜力，这些化合物属于前醇类脂质，可能包括脂肪酰胺、二萜类和视黄醇类物质。研究还强调，为了确定这些化合物的实际应用效果，需要进一步进行生物导向的分级和纯化，以评估其在反刍动物饲料中的适用性，并优化提取方法以提高效率和可持续性。此外，研究还提到，对于某些海藻种类，如Sargassum muticum，由于其具有入侵性且产生大量生物质，可能需要进一步研究其提取和纯化方法的资源效率和可扩展性。