从PANC-1 3D组织模型的scRNAseq数据中预测耐药亚群的数学策略：对吉西他滨耐药性以及TGFB1诱导的侵袭和EMT现象的深入理解

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Mathematical strategies for predicting resistant subpopulations from scRNAseq data of a PANC-1 3D tissue model: insight into gemcitabine resistance and TGFB1-induced invasion and EMT

单细胞RNA测序结合3D组织模型揭示胰腺癌化疗耐药机制及候选基因。通过构建含TGFβ1的SISmuc 3D模型，发现75% PANC-1细胞存活提示内在耐药，并利用gSELECT互信息基因筛选发现COL1A1、KRT18等10个关键基因，其表达与细胞周期调控及EMT相关，并通过生存分析验证临床相关性。

　　### 研究背景与意义

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC）是一种具有高度化疗耐药性和快速疾病进展特性的恶性肿瘤，给有效治疗带来了重大挑战。目前，传统的二维细胞培养模型在模拟肿瘤微环境和细胞间相互作用方面存在局限，难以准确反映PDAC的复杂生物学特性。相比之下，三维细胞模型在重现组织结构、细胞-基质相互作用以及肿瘤的侵袭性方面表现出更大的潜力。本研究通过构建基于脱细胞猪空肠组织的三维PANC-1肿瘤模型，结合转录组学和计算生物学方法，探索PDAC细胞对药物（如吉西他滨，GEM）和肿瘤微环境因子（如TGFβ1）的响应机制，旨在为治疗策略的优化提供新的分子靶点。

### 研究方法与技术路线

为了更真实地模拟PDAC的肿瘤微环境，研究团队采用了一种创新的三维培养技术，利用脱细胞猪空肠组织作为支架，结合TGFβ1刺激，构建了PANC-1细胞的三维模型。这种模型不仅保留了组织结构和细胞外基质（ECM）的完整性，还能够反映肿瘤微环境中的某些关键特征，如细胞外基质的密度和激活的间质细胞。此外，研究团队使用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，结合机器学习方法gSELECT，对不同处理条件下的细胞群体进行分析。gSELECT是一种基于互信息（Mutual Information, MI）的机器学习框架，能够识别不同细胞群体间具有高度区分力的基因，并用于评估子群的可分离性。

为了克服单细胞测序中因仅检测存活细胞而导致的偏差，研究团队引入了一种数学方法，通过计算未处理细胞与GEM处理后存活细胞之间的基因表达相似性，预测未处理细胞对GEM的敏感性。这一方法假设，未处理细胞中存在对GEM敏感和耐药的亚群，而耐药性并非在治疗过程中获得，而是存在于治疗前。通过定义最小余弦距离作为相似性指标，将未处理细胞分为“预测敏感”和“预测耐药”两组，从而能够更全面地分析肿瘤细胞对药物的响应机制。

### 研究结果与发现

研究结果表明，在三维模型中，约75%的PANC-1细胞存活了GEM处理，而二维模型中只有约38%的细胞存活。这一发现表明，PDAC细胞在三维培养条件下表现出更强的内在耐药性。进一步的分析显示，TGFβ1刺激不仅诱导了细胞的侵袭性，还显著增强了对GEM的耐药性，导致细胞表达模式的变化与GEM处理后的细胞相似。通过比较不同处理条件下的细胞群体，研究团队发现，TGFβ1处理后的细胞在基因表达上与GEM处理后的细胞存在显著重叠，但并未表现出明显的分离，这表明TGFβ1可能在GEM耐药性中起到了关键作用。

通过使用gSELECT方法对基因进行排序，研究团队识别出了一些具有高区分力的基因，这些基因在TGFβ1处理与未处理细胞之间表现出显著的表达差异。例如，KRT18、COL1A1、SERPINE1、TGFBI、MMP2、SPOCK1等基因在TGFβ1处理后显著下调，而其他基因如PMEPA1、TPM1、CDK1等则在处理后上调。这些基因不仅在三维模型中表现出显著的表达差异，还在临床数据中显示出与患者预后相关性。通过生存分析，研究团队发现这些基因的高表达与较差的生存率相关，进一步验证了它们在PDAC中的重要性。

此外，研究团队还利用STRING数据库对这些基因进行了蛋白互作分析，发现它们在细胞周期、上皮-间质转化（EMT）和凋亡等通路中高度相关。这些基因的表达模式与肿瘤细胞的侵袭性和耐药性密切相关，可能成为未来治疗PDAC的潜在靶点。例如，CDK1的表达与较差的预后相关，而其下调可能有助于提高GEM的敏感性。类似地，NUSAP1和TPX2等基因的表达变化可能反映了细胞周期调控的异常，这可能是PDAC细胞对GEM耐药性的分子基础。

### 讨论与意义

研究团队指出，传统的二维细胞培养模型在模拟PDAC的肿瘤微环境方面存在明显不足，导致对药物响应的预测能力有限。相比之下，三维模型能够更真实地反映肿瘤细胞的生理状态和微环境的影响，为研究PDAC的耐药性和侵袭性提供了更有价值的平台。此外，研究中发现的某些基因（如KRT18）在PDAC中的表达变化与临床预后密切相关，这提示这些基因可能在肿瘤的生物学行为中发挥关键作用。

研究还强调了机器学习方法在单细胞转录组学分析中的重要性。通过gSELECT方法，研究团队不仅能够识别出具有高区分力的基因，还能评估这些基因在预测治疗反应中的潜力。这种方法的引入，使得研究人员能够更有效地分析未处理细胞群体中的潜在耐药性亚群，从而为未来的药物筛选和靶点验证提供了新的思路。

然而，研究团队也指出了一些局限性。例如，由于GEM处理后的细胞数量有限，可能影响分析的深度和广度。此外，研究主要依赖于计算方法，而缺乏对这些基因功能的进一步实验验证。因此，未来的研究需要结合功能实验（如基因敲低或过表达）来进一步确认这些基因在PDAC耐药性中的具体作用。

### 结论与展望

综上所述，本研究通过构建三维PANC-1细胞模型，结合单细胞测序和机器学习分析，揭示了PDAC细胞对GEM和TGFβ1处理的响应机制。研究结果表明，TGFβ1能够显著诱导EMT和细胞耐药性，而GEM处理后的细胞在三维模型中表现出较高的存活率，提示其在临床中的有限疗效。通过识别出一系列与治疗反应相关的基因，研究团队为PDAC的分子机制研究和治疗靶点的筛选提供了新的视角。未来的研究可以进一步结合功能实验和临床样本分析，以验证这些基因在PDAC耐药性中的具体作用，并探索其在治疗策略中的应用潜力。此外，研究团队还建议在未来的工作中扩展gSELECT框架，以系统评估单细胞分析中数据量对结果解释力的影响，从而提高研究的可靠性和可重复性。