实验室评估了昆虫病原真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）以及杀虫剂苯甲酸埃玛菌（emamectin benzoate）单独使用或联合使用对苹果蠹蛾（Spodoptera frugiperda）的防治效果

《Crop and Environment》：Laboratory evaluation of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana, bacterium Bacillus thuringiensis, and insecticide emamectin benzoate treatments, alone and in dual combinations against Spodoptera frugiperda

斯氏枯叶蛾幼虫经白僵菌（Bb）、Bt毒蛋白及乙基多杀菌素（eb）单用或组合处理后，Bb+eb组合杀灭率最高（92.6%），显著延缓幼虫发育（21.2天）和成虫存活（9.4天），并降低卵孵化率（15.0%）。研究证实微生物与化学农药协同可增强防控效果，同时减少化学农药用量。

　　### 落叶蛾防治中的协同作用：生物与化学药剂的联合应用

#### 引言

**Spodoptera frugiperda**，即草地夜蛾，是一种全球性的农作物害虫，尤其对玉米造成严重威胁。由于其快速传播能力和高度适应性，草地夜蛾的防治工作面临巨大挑战。目前，广泛使用的化学杀虫剂在面对草地夜蛾时表现出逐渐增强的抗药性，这促使研究人员探索更可持续的防治策略，例如生物控制手段。生物控制方法包括利用微生物、植物提取物以及天然产物等，这些方法不仅能够有效控制害虫种群，还能减少对环境和非靶标生物的负面影响。

**Beauveria bassiana**（Bb）是一种广谱的昆虫病原真菌，已被广泛用于害虫防治。它通过孢子附着于昆虫体表、萌发并穿透表皮，进入昆虫体内后繁殖并释放毒素，最终导致宿主死亡。**Bacillus thuringiensis**（Bt）是一种革兰氏阳性菌，能够产生具有杀虫活性的晶体蛋白，这些蛋白在昆虫肠道内溶解后，通过与上皮细胞受体结合，引发细胞裂解，从而导致昆虫死亡。而**emamectin benzoate**（eb）则是一种高效的宏环内酯类杀虫剂，通过激活昆虫神经系统的氯离子通道，降低神经兴奋性，导致肌肉失控和死亡。

尽管这些药剂在单独使用时对草地夜蛾具有一定的防治效果，但它们在实际应用中可能面临抗药性问题。因此，探索它们之间的协同作用成为当前研究的重点。本研究评估了Bb、Bt和eb单独使用以及它们的双组合（Bb + Bt、Bb + eb、Bt + eb）对草地夜蛾3龄和5龄幼虫的杀灭效果及其对发育参数的影响。结果显示，Bb与eb的组合在杀灭率、发育时间延长和成虫寿命缩短方面表现出显著优势，这表明通过结合生物和化学药剂，可以实现更高效的草地夜蛾控制。

#### 材料与方法

##### 幼虫饲养与实验室条件

本研究使用的草地夜蛾实验室种群来源于巴基斯坦受感染的玉米田，并在**University of Agriculture Faisalabad**的微生物控制实验室中饲养。幼虫被置于人工饲料中，该饲料专门设计用于培养草地夜蛾幼虫。在进行实验前，幼虫被饥饿24小时，以确保其能够充分摄取处理后的饲料。幼虫被分别置于不同的塑料容器中，以避免同类相食，直到蛹化。成虫被喂食含有10%蜂蜜的棉片，并在25°C、70%相对湿度和14小时光照/10小时黑暗的条件下饲养。

##### 真菌培养与孢子悬浮液制备

实验中使用的**Beauveria bassiana**（Bb）菌株为GHA。该菌株在含有土豆葡萄糖琼脂（PDA）的培养皿中培养，培养条件为25°C、14:10小时光照/黑暗。孢子被刮取后，加入含有0.05% Silwet L-77的无菌水溶液，并与8颗3.5毫米直径的玻璃珠一起涡旋5分钟，以获得均匀的孢子悬浮液。最终浓度调整为1 x 10^6 spores/ml，并使用Neubauer血细胞计数板和400倍光学显微镜进行检测，确保孢子活性超过94%。

##### Bt毒素饲料制备

**Bacillus thuringiensis**（Bt）的商业制剂为DiPel湿粉，含有23.7%的**Bt** sp. **kurstaki**。通过将该制剂接种到营养肉汤中，并在32°C下培养3天，提取Bt菌体。随后，使用离心机（6000 rpm，15分钟）分离菌体，并用冷NaCl溶液、无菌蒸馏水进行洗涤。最终的Bt毒素悬浮液与人工饲料混合，搅拌30秒后冷却并固化，制成1 cm3的饲料块。

##### 化学杀虫剂饲料制备

**Emamectin benzoate**（eb）的商业制剂为EMA19，含1.9%的eb。将eb溶液加入人工饲料中，搅拌30秒后，在35°C下冷却并固化，制成1 cm3的饲料块。

##### 杀灭率实验

实验设置了六种处理方式：Bb、Bt、eb单独使用，以及Bb + Bt、Bb + eb、Bt + eb的组合处理。根据预实验结果，各处理的浓度分别为：Bb为1 x 10^6 spores/ml，Bt为0.75 μg毒素/g饲料，eb为0.06 ppm。对于Bb处理，采用幼虫浸泡法，即将幼虫浸入含有相应浓度的Bb悬浮液中30秒后，置于无菌饲料块中。对于Bt和eb处理，幼虫被置于含有相应处理的饲料块中48小时后，再转移到无处理饲料块中。组合处理则采用先让幼虫摄取一种处理的饲料块48小时，再将其浸入另一种处理的悬浮液中30秒，随后转移至无处理饲料块中。每种处理每龄期各处理30只幼虫，实验重复两次，共计60只幼虫。

##### 子致死剂量对发育的影响

在子致死剂量实验中，选择了导致约40%死亡率的处理浓度。对于Bb、Bt和eb的单独处理，分别使用1 x 10^4 spores/ml、0.4毒素/g饲料和0.03 ppm eb。组合处理则按照相同方式处理。幼虫被置于含有相应处理的饲料块中48小时后，转移到无处理饲料块中，并记录蛹化率、成虫羽化率和卵孵化率。实验重复两次，每处理组有三个子重复，共计90只幼虫。

##### 子致死剂量对发育时间的影响

为了评估子致死剂量对草地夜蛾不同发育阶段的影响，实验进一步研究了处理对幼虫发育时间、蛹化时间以及成虫寿命的影响。幼虫被置于处理后的饲料块中48小时，之后转移到无处理饲料块中，直到蛹化和羽化。成虫羽化后，被置于含有10%蜂蜜的容器中，进行交配1天后产卵。卵被转移到新的培养皿中孵化，并记录其发育过程。实验重复两次，每处理组有三个子重复。

##### 统计分析

所有数据均使用**Abbott公式**进行校正，以消除对照组的死亡率影响。数据在分析前进行**log(x + 1)**变换，以满足正态分布要求。使用**3-way ANOVA**分析死亡率数据，考虑时间、处理和龄期三个因素。对于蛹化率、成虫羽化率和卵孵化率，使用**2-way ANOVA**进行分析。使用**Tukey's HSD**进行多重比较，显著性水平为5%。所有统计分析均使用**Minitab软件**完成。

#### 结果

##### 幼虫死亡率

所有处理中，**Bb + eb**组合在不同时间点均表现出最高的死亡率。对于3龄幼虫，3天、5天和7天后，**Bb + eb**的死亡率分别为45.5%、63.6%和92.6%，显著高于其他处理。对于5龄幼虫，5天和7天后，**Bb + eb**的死亡率分别为55.6%和84.3%，同样显著高于其他处理。**Bt + eb**在3天后与**Bb + eb**的死亡率没有显著差异。这些结果表明，**Bb + eb**组合在杀灭草地夜蛾幼虫方面表现出更强的协同效应。

##### 发育过程

在发育过程方面，**Bb + eb**组合显著降低了蛹化率、成虫羽化率和卵孵化率。对于3龄幼虫，**Bb + eb**的蛹化率为92.0%，显著低于对照组（88.9%）。成虫羽化率在**Bb + eb**处理下为19.4%，显著低于其他处理。卵孵化率在**Bb + eb**处理下为15.0%，显著低于对照组（91.1%）。而**Bt + eb**处理下的卵孵化率为26.7%，也显著低于对照组。此外，**Bb + eb**处理下的幼虫发育时间显著延长，蛹化时间也显著增加，成虫寿命显著缩短。

##### 发育阶段的持续时间

在发育阶段持续时间方面，**Bb + eb**处理显著延长了卵孵化时间、幼虫发育时间和蛹化时间。例如，**Bb + eb**处理下的卵孵化时间为4.3天，显著高于对照组的2.4天。幼虫发育时间为21.2天，显著高于对照组的13.1天。蛹化时间为12.2天，显著高于对照组的8.2天。而成虫寿命在**Bb + eb**处理下为9.4天，显著低于对照组的12.3天。

#### 讨论

本研究的结果表明，**Bb + eb**组合在杀灭草地夜蛾幼虫方面表现出显著优势，这可能是由于两种药剂在不同生物功能上的协同作用。**Bb**通过穿透昆虫表皮并释放毒素，而**eb**则通过干扰昆虫神经系统和肠道微生物群，导致昆虫死亡。此外，**eb**的子致死剂量能够延长幼虫的发育时间，降低卵孵化率和成虫寿命，从而抑制草地夜蛾种群的增长。

**Bt**在单独使用时对草地夜蛾的杀灭效果相对较弱，这可能是由于其作用机制依赖于肠道内的毒素溶解和消化酶的作用。此外，不同**Bt**菌株的毒素类型和活性可能影响其对草地夜蛾的杀灭效果。例如，某些**Bt**菌株（如**aizawai**）可能对草地夜蛾更具活性，而**kurstaki**菌株的效果较弱。因此，**Bt**在与其他药剂（如**Bb**或**eb**）组合使用时，其效果可能得到增强。

在幼虫龄期方面，3龄幼虫比5龄幼虫更易受处理影响，这可能是由于年轻幼虫尚未形成强大的免疫防御系统。因此，**Bb + eb**处理对3龄幼虫的杀灭效果更显著。此外，子致死剂量的处理可能对草地夜蛾的繁殖能力产生影响，从而抑制其种群增长。例如，**eb**的子致死剂量能够显著降低成虫寿命，从而减少其繁殖机会。

#### 结论

本研究的结果表明，**Bb + eb**组合在杀灭草地夜蛾幼虫、延长发育时间和抑制种群增长方面表现出显著优势。这为草地夜蛾的综合防治提供了新的思路，即通过结合生物和化学药剂，既能有效控制害虫，又能减少化学药剂的使用量，从而实现更可持续的害虫管理。然而，进一步的田间试验仍需进行，以验证实验室结果在实际环境中的适用性。此外，研究还应关注不同**Bt**菌株与**Bb**或**eb**组合的效果差异，以及这些处理对其他昆虫的影响，以确保其在生态系统中的安全性和有效性。