综述：CRISPR-Cas9在急性髓系白血病中的应用：现状与未来展望

《Current Opinion in Pharmacology》：CRISPR-Cas9 in acute myeloid leukaemia: current state-of-art and future perspectives

本综述系统探讨了CRISPR-Cas9基因编辑技术在急性髓系白血病（AML）研究中的前沿应用，涵盖其在解析白血病发生机制、发现治疗新靶点及开发新型细胞疗法（如CAR-T）等方面的潜力，同时指出该技术在安全性（如脱靶效应）和临床应用层面面临的挑战与未来方向。

　　

引言

近年来，基因编辑技术的进步为精准医学开辟了革命性的新途径。在锌指核酸酶和TALEN（转录激活因子样效应物核酸酶）之外，CRISPR-Cas9技术在新一代个性化和分子医学中占据了主导地位。CRISPR是“成簇规律间隔短回文重复序列”的缩写，指的是源自病毒的短DNA序列，它们插入到细菌和古菌等原核生物的基因组中。Cas9（CRISPR相关核酸酶9）是一种能够在DNA上产生双链断裂（DSB）的酶。它与CRISPR序列共同构成了一种古老的RNA介导的细菌适应性免疫系统机制。将这一概念应用于真核细胞进行基因编辑是一项复杂任务，原因包括DSB后可能发生脱靶的插入或缺失。在真核细胞中，DSB是DNA修复机制的作用位点，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。大量证据表明，HDR是一种更精确的工具，而NHEJ则容易出错。因此，HDR被视为向基因组中插入新基因序列以重新激活特定基因的首选DNA修复机制，而NHEJ则用于破坏现有基因。尽管取得了最新进展，急性髓系白血病（AML）的总体预后仍不理想，迫切需要新的治疗策略。

伦理与安全问题

尽管基于CRISPR-Cas9的工程化技术为输血依赖性β-地中海贫血和镰状细胞病等疾病提供了潜在的治愈性疗法，但其安全性仍在研究中。主要的技术问题涉及脱靶效应，即在不预期的位置发生DNA切割，这可能破坏其他重要基因，导致有害后果，如癌症或遗传性疾病。

在解析复发性AML基因组改变如何驱动白血病发生中的作用

近年来，多项基于功能基因组学的研究旨在揭示AML中的特定基因突变是驱动疾病发生，还是仅参与其发病机制和进展。描述性基因组学在AML背景下的局限性在于无法识别突变事件之间的层级关系，以及这些改变与人体骨髓微环境在体内的关系。

CRISPR-Cas9在识别AML表观遗传依赖性和脆弱性中的应用

白血病发生的另一个较少为人知的机制依赖于DNA三维基因组结构的改变。例如，有证据表明，诸如inv(3)等结构变异（SV）可以通过改变增强子-启动子相互作用来驱动致癌基因的表达。CRISPR-Cas9技术已被用于研究染色质空间组织在白血病发生中的作用。

CRISPR-Cas9技术用于揭示AML代谢特异性

AML患者的铁代谢在系统和细胞水平均受损。特别是，高铁水平会促进嘌呤和嘧啶代谢，以支持髓系原始细胞的快速细胞代谢。铁死亡是一种新近描述的程序性细胞死亡类型，其基础是膜磷脂过氧化过程，由活性氧（ROS）和 redox-active 铁物种介导，并伴随GPX4基因的下调。铁死亡是AML的新治疗靶点之一。

CRISPR-Cas9筛选作为发现靶向药物开发遗传脆弱性的强大工具

为了理解AML中基因功能之间的层级关系以及潜在的AML遗传脆弱性，Lin等人在人类AML的原位异种移植模型中进行了体内CRISPR筛选。通过抑制肌醇代谢途径，发现溶质载体家族5成员3（SLC5A3）在AML患者来源异种移植（PDX）模型中对AML的生存至关重要。此外，膜相关RING-CH型指状蛋白5（MARCH5），一种线粒体E3泛素连接酶，被确定为AML的另一个潜在脆弱点。

CRISPR-Cas9基因编辑工具在开发AML细胞疗法中的作用

用于AML的CAR-T细胞疗法的发展仍然充满挑战。首先，自体CAR-T细胞受到患者来源T淋巴细胞质量差（通常在强化化疗后耗竭或数量减少）的限制。制造过程是个体化且耗时的，考虑到疾病的快速进展，这是一个关键问题。此外，AML缺乏理想的肿瘤特异性抗原。CD33和CD123等靶点也在正常的造血干细胞（HSC）和髓系祖细胞上表达，这带来了“靶向/脱肿瘤”毒性的风险，可能导致长期的骨髓抑制。CRISPR-Cas9技术为优化CAR-T细胞提供了新的可能性，例如通过敲除内源性T细胞受体（TCR）或HLA I类分子来生成通用型CAR-T细胞，或敲入编码新型CAR的基因。

自体/同种异体CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-CIK细胞的临床发展

在AML中选择用于生成和使用特定CAR产品的细胞群体具有挑战性。避免AML导向CAR-T疗法中“靶向/脱肿瘤”困境的一个概念性基石是序贯使用造血干细胞移植（HSCT），结合工程化造血干细胞（HSC）和CAR-T细胞。

结论

CRISPR-Cas9正在推动新一轮的临床前和临床研究，这些研究有潜力揭示以前未探索的基因依赖性、代谢细胞通路，并开发免疫疗法的新策略。这种方法代表了一种深刻的范式转变，并可能改变当前指导药物发现和临床开发的路径和方法，尤其是在临床试验的早期阶段。