最近引入的细叶桉（Eucalyptus nitens）与长期存在的球果桉（E. globulus）相比，其根系定殖能力较弱，外生菌根多样性较低，且对澳大利亚本土共生菌的依赖程度也更低

《Forest Ecology and Management》：Recently introduced Eucalyptus nitens shows lower root colonization, reduced ectomycorrhizal diversity, and less reliance on Australian symbionts than long-established E. globulus

西班牙西北部桉树（Eucalyptus nitens和E. globulus）与原生橡树林的ectomycorrhizal（ECM）真菌群落研究表明，宿主植物和栖息地均显著影响群落结构及多样性。E. globulus在橡树林中 colonization rate和真菌多样性更高，且主要与本地新相互作用真菌共生。尽管共引入澳大利亚真菌占比少，但Descolea maculata起关键作用。该研究揭示了植物、栖息地与真菌互作的复杂性，对桉树扩散评估有重要意义。

　　### 引言：全球物种迁移与生态系统变迁

在全球范围内，物种迁移已成为塑造生态系统的重要因素。这种迁移不仅改变了生物多样性的格局，也影响了生态系统的功能和稳定性。随着人类活动的加剧，越来越多的外来物种被引入到新的地理区域，其中一些物种能够成功适应并广泛传播。这些外来物种的成功不仅取决于其自身的生物学特性，还受到新环境条件的深刻影响，包括气候、土壤类型以及与其他物种的相互作用。在这些相互作用中，互利共生关系，如与真菌的根系共生，可能对植物在新环境中的建立和扩展起着关键作用。

根系共生真菌（mycorrhizal fungi）是许多植物成功定殖和扩展的重要因素。它们通过与植物根系形成共生关系，帮助植物吸收土壤中的养分，特别是磷和氮，同时增强植物对干旱、盐碱和病原菌的抵抗能力。这种共生关系对于植物在新环境中的适应至关重要。然而，外来物种在新环境中可能面临真菌共生体的缺乏，这可能成为其建立失败的一个关键限制因素。因此，理解外来物种如何与本地真菌建立共生关系，是评估其生态影响和预测其扩散潜力的重要途径。

在本研究中，我们关注的是两种外来树种——桉树（*Eucalyptus nitens* 和 *E. globulus*）——在西班牙西北部的两种生态系统中的根系共生真菌群落。这些树种虽然起源于澳大利亚，但已被引入到欧洲的多个地区，其中西班牙是重要的种植地之一。*E. globulus* 作为最早引入的物种之一，已经在那里种植了超过一个世纪，而 *E. nitens* 则是在较近的时期才被引入。这两种桉树在西班牙的种植区域主要集中在气候较为温和的地区，它们的生长特性使得它们在某些环境下更具优势。

研究外来物种与本地真菌的共生关系，有助于揭示其生态适应机制，以及这些共生关系如何影响其扩散潜力。同时，这也能为评估外来物种对本地生态系统的潜在影响提供重要信息。我们假设，由于 *E. nitens* 的引入时间较短，其根系共生真菌群落可能比 *E. globulus* 更不丰富，或者，由于其生长环境的差异，真菌群落的结构可能主要由栖息地决定。因此，本研究旨在探讨这两种桉树在不同栖息地中的根系共生真菌群落特征，以揭示其与本地生态系统之间的互动机制。

### 材料与方法：研究区域与实验设计

本研究在西班牙西北部的加利西亚地区进行，这里是西班牙最重要的林业区域之一。我们选择了三个地点，分别位于卢戈省（Lugo）：帕拉斯德雷伊（Palas de Rei）、奥特里奥德雷伊（Outeiro de Rei）和卡斯特罗德雷伊（Castro de Rei），这些地点彼此之间相距约30至50公里。加利西亚地区的气候属于海洋性气候（根据更新的K?ppen-Geiger分类为Csb），年降水量平均为1200毫米（范围在700至1900毫米之间），年平均气温约为13摄氏度，且每年平均有34天结霜（范围在10至58天之间）。这些气候条件与桉树的原生环境相似，使其能够在该地区成功生长。

我们还选择了三个地点，位于蓬特韦德拉省（Pontevedra）：坎加斯（Cangas）、蓬特卡尔德拉斯（Pontecaldelas）和科韦洛（Covelo），这些地点也彼此相距约20至35公里。这些地区的气候同样属于海洋性气候，年降水量平均为1800毫米（范围在781至3350毫米之间），年平均气温约为15摄氏度，且每年平均有26天结霜（范围在0至63天之间）。这些地点的气候条件也适合桉树的生长。

在每个地点，我们分别选择了桉树单一栽培区（*E. nitens* 或 *E. globulus*）和本地栎树（*Quercus robur*）森林。在每个栽培区，我们随机选取了三棵桉树进行根系采样，共计36个样本。为了减少空间自相关的影响，我们确保每棵树之间的距离至少为4米。每棵树的胸径（DBH）被测量，以评估树体大小对真菌群落的影响。我们挖掘并追踪了树根，从树干底部到细根（直径小于2毫米），以确保只包括目标树的根系。采样后的根系与土壤一起被小心收集，放入塑料袋中，运输至实验室后储存在4摄氏度的环境中，以便进行后续分析。

### 土壤特性分析

在每个研究地点，我们采集了土壤样本，共36个样本，每个样本为20厘米×20厘米，深度为20厘米。我们分析了土壤的pH值、有机质含量、有机碳、可利用磷、钾、镁、氮、碳氮比、阳离子交换容量（CEC）、钙镁比和钾镁比等参数。土壤分析在Areeiro植物病理学站进行。结果显示，与桉树种植区相比，栎树森林的土壤具有更高的氮含量和有机碳水平，以及更高的钾、镁和钙浓度，表明其在养分保留方面更为有效。此外，栎树森林的土壤通常比桉树种植区的土壤更不酸性，而桉树种植区的土壤则相对更酸性，这可能与铝离子浓度有关。在这些土壤中，钙镁比和钾镁比均显示出显著差异，进一步表明土壤条件对真菌群落的建立具有重要影响。

### 根系共生真菌的分类鉴定

为了确定根系共生真菌的种类，我们首先根据颜色、形状、质地、分枝类型、囊状细胞的存在、菌套类型、菌丝和菌根的特征，将根系样本分为不同的形态类型。这些形态类型随后被放入1.5毫升的Eppendorf管中，并在-20摄氏度下保存，以便进行分子分析。我们使用了EZNA真菌DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，美国）提取DNA，并通过Power Clean? Pro DNA纯化试剂盒（MoBio Laboratories Inc.）进行纯化。提取的DNA随后通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳条件为120伏特，持续20分钟，使用3微升的溴化乙锭进行染色。结果通过BioDoc-it LCD/FI-26紫外透射仪进行可视化。

我们使用了ITS1、ITS4、ITS1F、ITS4B、ITS5和ITS4A等通用引物，对核rDNA的ITS1、5.8S和ITS2区域进行PCR扩增。扩增的条件根据每种引物组合进行了优化，总体的扩增程序为：94摄氏度下预变性3分钟，随后进行40个循环，每次循环包括94摄氏度下变性30秒、55摄氏度下退火30秒、72摄氏度下延伸1分钟，最后在72摄氏度下进行10分钟的最终延伸。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。此外，我们还使用了直接PCR方法，这是一种更快、更经济的替代方法，允许直接从根系样本中扩增ITS片段，而无需DNA提取和纯化。直接PCR的程序为：95摄氏度下预变性6分钟，随后进行30个循环，每次循环包括94摄氏度下变性30秒、55摄氏度下退火30秒、72摄氏度下延伸1分钟，最后在72摄氏度下进行10分钟的最终延伸。

PCR产物随后被送往Macrogen实验室进行纯化和测序。我们使用BioEdit Sequence Alignment Editor 7.2.6对正向和反向序列进行比对和编辑。测序结果通过GenBank数据库进行查询，使用核苷酸-核苷酸BLAST（blastn）搜索选项。我们只考虑那些查询覆盖度在80%至100%之间，且E值为零的序列。分类依据为：相似度在90%至97%之间的序列被归类为属级，而相似度≥98%的序列则被归类为种级。对于由子囊菌 *Cenococcum geophilum* 定殖的根系，我们仅进行一次测序，随后根据其独特的形态特征进行分类。真菌的命名遵循Species Fungorum网站（www.indexfungorum.org）的标准。

### 地理分布与相互作用模式

我们根据植物和真菌的起源，对植物-真菌相互作用模式进行了分类（Dickie et al., 2017；见补充表S2）。为了确定记录的真菌种类的原生分布，我们参考了文献资料（Vellinga et al., 2009；Vlk et al., 2020）以及DiscoverLife.org、nzfungi.landcareresearch.co.nz、www.ala.org.au/blogs-news/fungimap-putting-australian-fungi-on-the-map 和 www.gbif.org 提供的分布图和记录。这些数据帮助我们识别了真菌的原生范围，并确定了它们与桉树的相互作用类型。

### 根系共生真菌群落的丰富度与多样性

在分析中，我们计算了每株植物的根系共生真菌丰富度（S）和香农-维纳多样性指数（H’）。我们对根系样本进行了切割，每株植物的样本大约为220个1厘米的片段。通过网格线交点法（Brundrett et al., 1996），我们估算了根系共生率（总共生根尖数/总根尖数）。这些根尖被随机分布在一个直径为9厘米的培养皿中，并在显微镜下进行计数。随后，我们通过分子分析确定了每株植物的真菌种类，并计算了每种真菌的相对丰度（总根尖数/总共生根尖数）、绝对频率（具有该真菌种类的植物数/总采样植物数）和相对频率（绝对频率/所有种类的绝对频率之和），以评估每种真菌在群落中的重要性。我们还使用了相对频率和相对丰度的总和作为衡量每种真菌在群落中重要性的指标。

### 数据分析

我们通过双因素方差分析（two-way ANOVA）评估了根系共生率和真菌种类丰富度的差异，固定因素为宿主植物种类（*E. nitens* 与 *E. globulus*）和栖息地（桉树种植区与本地栎树森林），并考虑了它们的交互作用。同时，我们将树干直径（DBH）作为协变量。在进行分析之前，我们通过Kolmogorov–Smirnov检验和Levene检验验证了方差分析的前提条件（正态性和方差齐性）。所有分析均使用GenStat 7th ed.（VSN International，Hemel Hempstead，UK）进行。

为了评估不同处理间根系共生真菌群落组成的差异，我们使用了相似性分析（ANOSIM），以评估栖息地和桉树种类的影响。相对频率作为响应变量，用于计算真菌种类的相似性。非度量多维尺度分析（NMDS）用于可视化不同处理之间的差异，展示了它们在物种组成空间中的距离。ANOSIM和NMDS均基于平方根转换后的Bray–Curtis相似性。所有分析均在RStudio中进行，使用了metaMDS和anosim命令，并进行了999次排列以检验统计显著性。

### 结果

在本研究中，我们共检查了36,390个根尖，其中5,928个为根系共生真菌，产生了45种形态类型。通过分子分析，我们确定了36种根系共生真菌（35种担子菌和1种子囊菌），分布在17个属、26个种以及1种未鉴定的根系共生真菌（可能属于*C. geophilum*群，见补充材料表S2）。总体而言，18种真菌种类与*E. nitens*相关，而25种与*E. globulus*相关。在桉树种植区，我们检测到15种真菌种类，而在本地栎树森林中检测到29种。在桉树种植区，*E. nitens*有11种真菌种类，而*E. globulus*有7种；在本地栎树森林中，*E. nitens*有12种，*E. globulus*有21种。

结果显示，宿主植物种类和栖息地对根系共生率有显著影响，而树干直径（DBH）则没有显著影响。图1显示，*E. nitens*的平均根系共生率显著低于*E. globulus*，且在两种栖息地中均未观察到宿主与栖息地之间的显著交互作用。此外，两种桉树在栎树森林中的根系共生率均高于在桉树种植区中的根系共生率。值得注意的是，*E. globulus*在栎树森林中的根系共生率几乎是*E. nitens*在桉树种植区中的两倍。

在真菌种类丰富度方面，我们发现宿主植物种类和栖息地的交互作用对丰富度有显著影响，而树干直径则没有显著影响。在桉树种植区，两种桉树的真菌种类丰富度相似，而在本地栎树森林中，*E. nitens*的真菌种类丰富度低于*E. globulus*。此外，*E. globulus*在本地栎树森林中的真菌种类丰富度显著高于在桉树种植区中的丰富度，这与我们之前的假设一致。*E. nitens*的真菌种类丰富度在两种栖息地中相似，而*E. globulus*的丰富度在本地栎树森林中显著增加。

在根系共生真菌群落组成方面，ANOSIM分析显示宿主植物种类和栖息地对群落组成有显著影响。*E. nitens*和*E. globulus*在不同栖息地中表现出不同的真菌群落组成，但它们在相同栖息地中的群落组成相似。在本地栎树森林中，*E. nitens*的真菌群落与*E. globulus*的真菌群落有显著差异，而在桉树种植区中，这种差异不显著。NMDS图（图3）显示，四种处理（两种桉树在两种栖息地中）在NMDS空间中形成了不同的区域，表明它们在真菌群落组成上存在显著差异。同一桉树种类的树木在图中显示出更高的相似性，而不同栖息地的树木则显示出更大的差异。*E. nitens*的树木在图中表现出更大的分散性，而*E. globulus*的树木则形成了两个紧密的集群，表明其真菌群落组成更为一致。

### 讨论：宿主植物与栖息地对根系共生真菌的影响

本研究的结果表明，宿主植物种类和栖息地对根系共生真菌群落具有显著影响，尤其是在物种丰富度、根系共生率和群落组成方面。尽管这两种桉树的根系共生真菌群落并非严格依赖于特定的宿主植物，但它们对某些真菌种类表现出明显的偏好，尤其是在澳大利亚共引入的真菌中。这种偏好可能与真菌在原生范围中与桉树共同进化的互利关系有关，这种关系可能通过自然选择在原生环境中形成，并在新环境中得以维持。

例如，*Descolea maculata* 在两种桉树的根系中均占据主导地位，尤其在桉树种植区中，它是最常见的共生真菌之一。在本地栎树森林中，*D. maculata* 也是重要的共生真菌之一，但在*E. nitens*的根系中却未被检测到。这一现象可能反映了*E. nitens*在本地栎树森林中建立共生关系的困难，尤其是在早期阶段。*D. maculata* 的缺乏可能成为*E. nitens* 在本地森林中扩展的一个障碍。

另一方面，*Laccaria bicolor* 在*E. nitens* 的根系中表现出显著的主导地位，尤其是在本地栎树森林中，而*Descomyces* sp. 则在*E. globulus* 的根系中占据次要地位。这种差异可能与*E. nitens* 和 *E. globulus* 的不同生态适应策略有关。*E. globulus* 在本地栎树森林中与更多本地真菌建立共生关系，而*E. nitens* 则可能更依赖于共引入的澳大利亚真菌。这表明，尽管两种桉树在新环境中都能建立共生关系，但它们的共生网络可能受到不同因素的影响。

此外，*Cenococcum geophilum* 在两种桉树的根系中均表现出较高的重要性，尤其是在本地栎树森林中。然而，由于*E. nitens* 在本地森林中的共生关系建立较晚，*C. geophilum* 的存在可能反映了其在本地环境中的适应过程。*C. geophilum* 的广泛分布和适应性使其成为一种重要的共生真菌，能够在多种宿主植物中建立关系。这一发现进一步支持了“生物市场”理论，即植物和真菌通过选择性奖励，建立互利关系。

在本地栎树森林中，我们观察到许多新型的真菌-植物相互作用。这可能与本地真菌的多样性有关，因为本地森林通常具有较高的生物多样性，而桉树种植区则以单一的植物种类为主。这种高多样性可能促进了新的共生关系的建立，使得外来物种能够利用本地真菌资源。相比之下，桉树种植区的真菌种类相对较少，这可能限制了其与本地真菌的互动，导致其共生网络较为单一。

此外，我们发现*E. nitens* 的根系共生率低于*E. globulus*，这可能与其较短的引入历史有关。*E. globulus* 在本地栎树森林中已经建立了更广泛的共生关系，而*E. nitens* 仍处于建立这些关系的早期阶段。因此，*E. globulus* 可能具有更高的共生效率，从而支持其在本地森林中的扩展。

### 结论：外来树种与本地真菌的共生关系

本研究的结果表明，*E. globulus* 和 *E. nitens* 与本地和共引入的真菌共生关系对其在西班牙西北部的扩展具有重要影响。这两种桉树的根系共生真菌群落受到宿主植物种类和栖息地类型的共同作用，从而影响了共生率、真菌种类丰富度和群落组成。*E. globulus* 由于其更长的引入历史，可能已经建立了更广泛的共生网络，从而支持其在本地森林中的扩展。相比之下，*E. nitens* 的共生网络仍在发展过程中，其扩展可能依赖于本地真菌的进一步适应和引入。

这些发现有助于我们理解外来树种在新环境中的生态适应机制，以及它们如何通过与本地真菌的相互作用影响生态系统的结构和功能。同时，它们也强调了在评估外来物种对本地生态系统的潜在影响时，必须考虑其与本地真菌的共生关系。未来的研究应进一步探讨桉树与本地真菌之间的相互作用，以更全面地了解其生态影响。此外，考虑到桉树可能形成两种类型的根系共生关系（ECM和AM），未来的研究还应包括对AM真菌的分析，以提供更完整的生态视角。