内生真菌Fusarium sp. DN689基因组揭示石斛碱生物合成通路的开创性研究

《Genomics》：Genomic insights into dendrobine biosynthesis in the endophytic fungus Fusarium sp. DN689

本研究针对具有显著药理活性但可持续生产困难的石斛碱，以内生真菌Fusarium sp. DN689为研究对象，通过全基因组测序与挖掘，系统鉴定了其萜类生物合成基因簇，并发现关键环化酶与氧化酶基因的表达与石斛碱积累正相关，首次构建了真菌合成石斛碱的基因组框架，为这一珍贵化合物的代谢工程与绿色生产奠定了坚实基础。

　　

石斛（Dendrobium nobile）是我国传统名贵中药材，其特有的活性成分——石斛碱（dendrobine），是一种倍半萜生物碱（sesquiterpene alkaloid），研究表明其具有神经保护、抗肿瘤、免疫调节等多种显著的药理活性，应用前景广阔。然而，石斛的自然生长周期漫长，且石斛碱在植物体内含量极低，导致从植物中直接提取不仅成本高昂，更难以满足市场需求，其可持续供应已成为制约相关药物研发与应用的重大瓶颈。与此同时，过度采挖野生石斛也对生态环境造成了压力。因此，寻找一种不依赖植物资源、可实现高效可控生产的石斛碱新来源，成为了该领域亟待解决的关键科学问题。

在这一背景下，科学家们将目光投向了与植物共生、通常不引起病害的内生真菌。内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，且具有培养条件简单、生长周期短、易于进行工业化发酵生产等独特优势，是解决植物源稀有天然产物供应问题的理想突破口。此前，已有研究从石斛中分离出能产生石斛碱的内生真菌，但其合成能力的稳定性、产量以及背后的分子机制均不甚明了，限制了其进一步的应用开发。

为了解决上述问题，本研究团队将焦点锁定于一株从金钗石斛中分离得到的内生真菌——Fusarium sp. DN689。研究人员首先确认了该菌株在液体发酵条件下能够稳定地产生石斛碱，这为其作为石斛碱的“微生物细胞工厂”提供了可能性。那么，这株小小的真菌是如何合成出结构复杂的石斛碱的呢？其遗传蓝图里隐藏着怎样的合成密码？为了揭开这些谜团，研究人员开展了一项系统性的基因组学研究，相关成果发表在《Genomics》上。

为解析Fusarium sp. DN689合成石斛碱的遗传基础，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，对菌株进行全基因组测序，并利用生物信息学工具深入挖掘其基因组中的萜类生物合成基因簇（BGCs）；其次，采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，检测候选基因的表达水平，并与发酵过程中石斛碱的积累量进行相关性分析；最后，对关键的候选酶基因进行功能鉴定，以确认其在石斛碱生物合成通路中的作用。

全基因组测序与萜类生物合成基因簇鉴定

通过对Fusarium sp. DN689进行全基因组测序和生物信息学分析，研究人员成功绘制了其完整的遗传图谱。深入挖掘后，共鉴定出13个与萜类化合物合成相关的基因簇。这些基因簇包含了负责合成萜类骨架核心前体的甲羟戊酸（MVA）途径的关键酶基因，以及一系列可能参与石斛碱结构修饰的下游“精修”酶（如氧化酶、甲基转移酶等）的编码基因。这一发现首次从基因组层面揭示了该菌株具备合成复杂萜类 alkaloid 的巨大潜力，为解析石斛碱的具体合成路线提供了宝贵的“基因地图”。

候选基因表达与石斛碱积累的相关性分析

在鉴定出的众多基因中，哪些才是真正参与石斛碱合成的关键基因？为了回答这个问题，研究人员选取了多个候选的环化酶和氧化酶基因，利用qPCR技术监测它们在发酵过程中的表达动态。结果发现，其中有四个基因的表达模式与培养基中石斛碱的积累量呈现出显著的正相关关系。这意味着，当石斛碱产量升高时，这四个基因的转录活性也同步增强，强烈提示它们直接参与了石斛碱的生物合成过程。这一相关性分析有效地从众多候选基因中筛选出了最有可能的“目标基因”，缩小了后续功能验证的范围。

关键环化酶的功能鉴定

在相关性分析筛选出的候选基因中，一个编码倍半萜环化酶（sesquiterpene cyclase）的基因尤为引人注目。环化酶是萜类合成通路中的核心酶，负责将线性的前体分子环化形成特定的碳骨架，这通常是决定最终产物结构的关键步骤。研究人员对该环化酶基因进行了深入的功能研究，证实其编码的酶能够催化生成石斛碱生物合成途径中一个关键的中间体。因此，该环化酶被确定为石斛碱生物合成通路中的一个关键酶。这一发现不仅确认了一个具体的合成步骤，更重要的是，它为通过基因工程手段增强该酶活性、进而提高石斛碱产量提供了直接的分子靶点。

本研究通过对内生真菌Fusarium sp. DN689的系统性基因组学与分子生物学研究，首次构建了真菌合成石斛碱的遗传框架。研究不仅证实了该菌株作为石斛碱可持续生产源的可行性，还通过全基因组挖掘鉴定出13个萜类生物合成基因簇，并通过表达相关性分析和功能验证，成功定位并证实了一个倍半萜环化酶是石斛碱合成通路中的关键酶。这些研究成果具有多重重要意义：在理论层面，它初步揭示了石斛碱在微生物中的生物合成路径，增进了我们对微生物次生代谢产物合成复杂性的理解；在应用层面，该研究为利用合成生物学和代谢工程策略改造真菌底盘细胞、构建高效的石斛碱工程菌株奠定了坚实的分子基础，为最终实现石斛碱的绿色、可持续工业化生产开辟了全新的技术路线，有望突破从石斛植物中提取的瓶颈，推动以其为原料的新药研发与产业发展。