无症状携带者鼻咽部流感嗜血杆菌宿主内基因组变异研究：多功能蛋白编码基因的发现与意义

《The American Journal of Pathology》：Intra-host genomic variation of Haemophilus influenzae isolates from asymptomatic nasopharyngeal carriers involves genes encoding proteins with diverse inferred functions

本研究针对流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)在人类无症状携带过程中的基因组变异机制尚不明确的问题，通过对24名健康儿童鼻咽部分离的805株菌株进行全基因组测序，发现120个基因存在非同义或无义SNPs，其中69个基因在多个儿童中反复出现变异。这些变异基因编码的蛋白功能多样，包括转录调控因子和毒力因子，为理解细菌在宿主内适应性进化提供了重要模型。

　　

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）是一种严格人类寄生的革兰阴性球杆菌，既是导致中耳炎、脑膜炎等严重感染的病原体，又是上呼吸道的常见无症状定植菌。尽管针对b型流感嗜血杆菌（Hib）的疫苗已显著降低了相关严重感染，但无荚膜（不可分型）菌株引起的感染和携带依然普遍，尤其在儿童群体中。细菌在宿主体内生存和进化过程中，其基因组会发生变异，这种发生在同一宿主内的基因组变异（intra-host genomic variation）是微生物适应宿主环境、维持定植和潜在致病性的重要机制。然而，对于流感嗜血杆菌在人类无症状携带状态下，哪些基因最容易发生改变蛋白质功能的单核苷酸多态性（SNP），目前知之甚少。理解这一过程对于揭示细菌定植、进化以及向致病状态转变的机制至关重要。为此，研究人员在《The American Journal of Pathology》上发表了最新研究成果，系统描绘了流感嗜血杆菌在健康儿童鼻咽部无症状携带过程中的基因组变异图谱。

为了深入探究这一问题，研究团队对来自24名健康冰岛儿童鼻咽拭子的805株流感嗜血杆菌分离株进行了全面的基因组学分析。研究的关键技术方法包括：从冰岛雷克雅未克地区日托中心健康儿童（队列来源）采集鼻咽拭子并进行细菌培养鉴定；对所有分离株进行Illumina短读长测序，并对代表不同多位点序列分型（MLST）的菌株进行牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序以构建闭环参考基因组；利用生物信息学工具进行MLST分型、核心基因组确定、系统发育分析以及相对于个体化参考基因组的SNP检测和功能注释。

基因内容分析

研究人员首先通过MLST分析了805株分离株的遗传背景，共鉴定出39个不同的“儿童-MLST”组。其中17名儿童携带单一MLST型的菌株，而7名儿童同时携带多种MLST型的菌株，表明存在不同谱系菌株的共定植。基因含量分析显示所有菌株均为无荚膜型，且大多数不携带质粒复制子或抗菌素耐药基因，仅在少数儿童分离株中检测到TEM-1D β-内酰胺酶。

系统发育分析

基于核心基因组SNP构建的系统发育树显示，39个“儿童-MLST”组之间存在显著的基因组多样性，差异SNP位点占核心基因组核苷酸的10.3%。即使来自不同儿童的相同MLST型菌株也形成了不同的亚群，提示它们在各自宿主体内经历了独立的分子进化路径。

宿主内遗传变异分析

研究的核心发现在于对宿主内基因组变异的精细刻画。通过为每个“儿童-MLST”组构建闭环参考基因组，并与该组内其他分离株进行比对，研究人员鉴定出120个基因在至少一个分离株中获得了非同义（氨基酸改变）或无义（蛋白质截短）SNP，约占平均基因总数的6.3%。值得注意的是，有69个基因在来自多个儿童的分离株中反复出现多态性（即复现性多态性），72个SNP在同一儿童内的多个分离株中出现。这些发生变异的基因编码的蛋白质功能十分广泛，主要涉及转录与翻译、小分子转运、细胞壁生物合成、转录调控、环境应激反应、碳水化合物代谢、糖脂代谢、铁代谢、氨基酸代谢、重组与修复以及毒力等。其中，两个与免疫球蛋白A（IgA）相互作用的推定毒力因子基因（esiB和iga）的变异尤为引人注目。

复现性多态性基因的多样化选择

为了探究这些复现性多态性基因是否受到正向选择压力，研究人员分析了69个基因中461个变异等位基因的核苷酸变化。发现变异显著集中在密码子的前两位，且dN/dS比值为2.25，强烈支持了这些基因的变异是多样化选择（diversifying selection）驱动的结果，而非中性进化。

该研究首次在大规模样本上系统揭示了流感嗜血杆菌在人类鼻咽部无症状携带过程中广泛的宿主内基因组变异。与从中耳炎感染部位分离的菌株相比，无症状携带菌株的变异基因谱存在显著差异，仅三个基因（nanK, patB, phoR）在两个部位共同呈现复现性多态性，提示不同解剖部位的微环境对细菌施加了独特的选择压力。特别重要的是，在携带菌株中发现了转录调控因子和靶向IgA的毒力因子相关基因的变异，这为了解细菌如何通过基因组微调以适应宿主免疫环境（如IgA介导的黏膜免疫）并维持无症状定植状态提供了新线索。例如， PhoR（磷酸盐调控组传感器蛋白）在两个部位都是高频变异基因，推测其变异可能有助于细菌适应鼻咽部和中耳这些可能限制磷酸盐利用的环境。而IgA结合蛋白（EsiB）和IgA1蛋白酶（Iga）的变异，则可能通过改变与宿主IgA的相互作用，来调节免疫反应，从而有利于无症状定植的维持。

总之，这项研究不仅绘制了流感嗜血杆菌无症状携带状态下宿主内基因组变异的精细图谱，揭示了其背后潜在的适应性进化机制，还为理解其他呼吸道病原体的定植和进化提供了可借鉴的模型。研究结果强调了宿主微环境在驱动病原体基因组多样性中的关键作用，对未来开发针对细菌定植和早期感染的干预策略具有重要的启示意义。未来的研究可以扩展到不同地理人群、不同解剖部位以及从携带到感染的动态过程，进一步揭示流感嗜血杆菌致病性演化的完整路径。