转录因子在T滤泡辅助细胞扩增及向T调节型1细胞分化中的背景依赖性调控机制

《Cell Reports》：Contextual regulation of T follicular helper cell expansion and differentiation into T regulatory type 1 cells by multiple transcription factors

本研究揭示了20种转录因子在自身反应性TFH细胞经重复抗原刺激分化为TR1细胞过程中的多层次调控网络。研究人员通过单细胞测序和条件性基因敲除技术，发现c-MAF、IRF4、BCL-6等11个关键转录因子以细胞阶段特异性方式协同调控TFH-TR1轴上的细胞命运转换和特异性基因程序表达，为自身免疫性疾病治疗提供了新的理论依据。

　　

在免疫学领域，T细胞分化的精细调控一直是研究的重点。传统观点认为，不同T细胞亚群由特定的"主调控"转录因子决定其命运。然而，当T滤泡辅助细胞（T_FH）在重复抗原刺激下转分化为具有免疫调节功能的T调节型1（T_R1）细胞时，这一过程的转录调控网络却鲜为人知。

研究团队前期发现，用携带单一自身免疫性疾病相关肽-MHCII类分子（pMHCII）的纳米颗粒（NP）治疗小鼠，能够在多种自身免疫疾病模型中特异性缓解炎症而不损害正常免疫力。这种pMHCII-NP疗法通过系统性地扩增特异性T_FH细胞，并将其重编程为两个不同的抗炎性T_R1细胞亚群（Foxp3^-和Foxp3⁺）发挥作用。这一T_FH向T_R1细胞的转分化过程经过一个称为T_R1.1的过渡细胞阶段，不涉及组蛋白标记、DNA甲基化或活性增强子分布的重大变化，而是与开放染色质的收缩和转录因子（TF）表达的重大变化相关。

为了揭示调控这一过程的关键分子机制，Garnica等人在《Cell Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们提出一个核心科学问题：在T_FH细胞向T_R1细胞转分化的多步骤过程中，特定的转录因子是发挥固定的、谱系特异性的作用，还是其功能依赖于细胞所处的转录状态（即上下文依赖性）？

研究人员采用了一种综合性的实验策略，结合开放染色质区域中TF结合基序富集分析和TF基因表达动力学，筛选出20个可能在抗原诱导的cognate T_FH细胞扩增及其向T_R1.1和/或T_R1.2细胞重编程过程中发挥作用的TF。这些TF根据其表达模式被分为五类：主要表达于T_FH细胞群；在T_FH细胞中表达但在T_R1.1和T_R1.2阶段上调；由T_{R1.1和TR1.2细胞共同表达；仅由TR1.2细胞表达；以及在整个TFH-TR1细胞轴上表达。}

研究的关键技术方法包括：利用pMHCII纳米颗粒（pMHCII-NP）在NOD小鼠模型中诱导抗原特异性T细胞应答；构建T细胞特异性条件性基因敲除（cKO）小鼠模型（涉及20个转录因子基因）；通过流式细胞术分析免疫细胞亚群比例和功能；应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析T细胞分化轨迹和转录组特征；采用非负矩阵分解（NMF）鉴定细胞亚群特异性基因表达程序；通过伪时间轨迹分析重构细胞分化路径。实验所用小鼠样本来自特定病原体（SPF）级饲养的转基因品系。

TFs对TF_H-T_R1通路的多层次调控

研究发现，20个被研究的TF中，有11个在T_FH-T_R1转分化途径的不同阶段扮演关键角色，且其作用具有显著的背景依赖性。这些TF不仅调控特定细胞转换事件，还以阶段特异性方式调控亚群特异性基因的表达。

c-MAF在T_FH细胞扩增和T_R1.1形成抑制中起关键作用，但同时是T_R1.2转录程序规范所必需的。c-MAF缺陷小鼠的T_FH细胞形成受损，pMHCII-NP诱导的抗原特异性T细胞扩增大幅减少。有趣的是，残存的少量T细胞主要呈现T_R1.1表型，提示c-MAF正常情况下抑制T_FH向T_R1.1的转换，同时促进T_R1.1向T_R1.2的分化。

IRF4同样是T_FH细胞形成和扩增所必需的，但其缺失还导致T_R1.1向T_R1.2转化的完全阻断。与c-MAF不同，IRF4对于终末T_R1.2细胞的分化是不可或缺的，突显了其在细胞分化晚期阶段的独特作用。

BCL-6的表现尤为引人注目。尽管BCL-6仅表达于T_FH阶段，但其缺失对后续产生的T_R1细胞具有持久的转录"印记"效应。BCL-6缺陷型T_FH细胞产生的T_R1细胞高表达多种细胞因子，表明BCL-6在T_FH阶段的表达可持续抑制其后代细胞的细胞因子基因表达。研究人员还发现，在BCL-6条件性敲除小鼠中，尽管T_FH阶段后Bcl6基因转录停止，但BCL-6蛋白仍可在T_R1.1细胞中持续存在，这可能部分解释了其跨阶段的调控效应。

转录因子的上下文依赖性功能

研究最显著的发现之一是转录因子功能的上下文依赖性。同一个转录因子在细胞分化途径的不同阶段可能发挥完全相反的作用。

例如，T-BET在T_FH细胞中促进其增殖，同时抑制T_R1.1和Foxp3^-T_R1.2特征基因的表达；而在Foxp3^-T_R1.2细胞中，T-BET反而促进该亚群特征基因的表达。类似地，c-MAF在所有四个亚群中均促进T_FH特征基因的表达，但在T_FH细胞中抑制T_R1特征基因，在T_R1.2细胞中则促进T_R1特征基因的表达。

BLIMP-1（由Prdm1编码）的作用模式也十分复杂。它抑制pMHCII-NP诱导的T_FH细胞扩增，但又是T_R1.1向T_R1.2转化所绝对必需的。BLIMP-1缺陷小鼠完全缺乏Foxp3^-T_R1.2和Foxp3⁺T_R1.2细胞，尽管其T_FH和T_R1.1细胞数量增加。

BATF和STAT-3在T_FH细胞形成和扩增中必不可少，同时促进Foxp3^-T_R1.2细胞向Foxp3⁺T_R1.2细胞的转化。而ATF-6、BHLHE40和STAT-4虽然对细胞亚群的形成影响较小，但对T_R1.2细胞产生IL-10至关重要。

细胞特异性基因表达程序的协同调控

研究人员通过非负矩阵分解（NMF）鉴定了四个稳定的基因元程序（MP），这些程序在所有样本的相应亚群中保持一致。这些元程序可靠地捕捉了每个Tet⁺亚群在不同批次和样本中的转录特征。

研究发现，多个TF以协同或拮抗的方式共同调控亚群特异性基因表达程序。例如，BATF和IRF4在T_R1.1细胞中具有叠加/协同效应，而c-MAF和T-BET在T_R1.1细胞中则相互拮抗。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示了多个转录因子在T_FH-T_R1转分化轴上的上下文依赖性调控作用。研究发现，c-MAF、IRF4、BCL-6、BATF和STAT-3等转录因子不仅为T_FH细胞的形成和维持所必需，同时还抑制T_FH向T_R1.1细胞的转化。在转分化的后期阶段，c-MAF、IRF4、BATF和STAT-3又促进T_R1.2细胞的形成并调控IL-10等T_R1特征性基因的表达。

特别值得注意的是，BCL-6在T_FH细胞中的表达对其T_R1细胞后代具有持久的转录抑制效应，即使这些后代细胞本身已不表达BCL-6。这种现象揭示了转录因子可通过蛋白持久性等方式实现跨阶段调控的新机制。

研究还发现，转录因子对基因表达的影响高度依赖于细胞所处的转录背景。同一转录因子在不同细胞阶段可能对同一基因发挥完全相反的调控作用，这种灵活性使得有限的转录因子能够协调复杂的细胞命运决定过程。

这些发现不仅深化了我们对T细胞可塑性和分化调控机制的理解，也为开发针对自身免疫性疾病和炎症性疾病的新治疗策略提供了重要理论基础。通过精确调控特定转录因子的活性或表达，可能有望指导T细胞向期望的免疫调节方向分化，从而实现更精准的免疫干预。

研究的局限性包括未直接测量全基因组范围内TF结合动态，以及需要进一步考虑TF蛋白在基因表达停止后的持久性效应。未来的研究结合单细胞CUT&Tag/RNA-seq技术将有助于更精确地建立TF结合与基因表达变化之间的因果关系。

这项工作由Josep Garnica、Jun Yamanouchi等研究人员共同完成，通讯作者为Pere Santamaria。研究得到了Genome Canada、加拿大卫生研究院（CIHR）等多个机构的资助支持，相关数据已保存在GEO数据库（登录号：GSE291030）中。