m6A阅读器IGF2BP2通过清除DNA-RNA杂交体促进同源重组介导的DNA修复

《Cell Reports》：The m6A reader IGF2BP2 promotes homologous recombination-mediated DNA repair by eliminating DNA-RNA hybrids

本刊编辑推荐：为解决DNA双链断裂(DSB)修复过程中DNA-RNA杂交体动态调控机制不清的问题，研究人员开展了m6A阅读器IGF2BP2在DNA损伤修复中功能机制的主题研究，发现IGF2BP2以m6A依赖方式招募DHX9解旋酶至DSB位点清除杂交体，促进RAD51装载和同源重组(HR)修复，揭示了靶向IGF2BP2可增强肿瘤细胞对DNA损伤疗法的敏感性，为癌症治疗提供了新策略。

　　

当细胞遭遇DNA双链断裂(Double-Strand Break, DSB)这类最严重的DNA损伤时，同源重组(Homologous Recombination, HR)修复机制犹如一位精细的修理工，能利用姐妹染色单体的同源序列作为模板进行无差错修复，守护基因组的稳定性。然而，这个修复过程并非一帆风顺。在DSB位点形成的DNA-RNA杂交体（一种由DNA链和RNA链杂交形成的结构）扮演着双面角色：早期它们有助于招募BRCA1、BRCA2等修复蛋白，但若滞留不去，又会阻碍关键重组酶RAD51的加载，反而妨碍修复完成。近年来，科学家发现RNA上最常见的化学修饰——N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)——也参与了DNA损伤修复的调控，但其具体作用机制，尤其是在调控DNA-RNA杂交体命运方面的“双向开关”角色，仍是一个待解的谜团。发表在《Cell Reports》上的这项研究，正是瞄准了这一科学前沿。

为了深入探索m⁶A修饰在DSB修复中的具体作用机制，特别是哪些“阅读器”蛋白能识别损伤位点的m⁶A信号并执行功能，研究人员运用了多种关键技术。他们利用小干扰RNA(siRNA)文库系统性敲低各类m⁶A调控因子，结合免疫荧光技术检测DNA损伤标志物γH2AX焦点形成，筛选出关键蛋白。通过染色体免疫共沉淀(ChIP)和位点特异性内切酶I-Ppol诱导系统，验证了目标蛋白在DSB位点的招募。采用串联亲和纯化(TAP)与质谱分析(MS)寻找相互作用蛋白，并通过免疫共沉淀(Co-IP)和邻近连接技术(PLA)进行验证。利用DNA-RNA杂交体特异性抗体S9.6进行免疫荧光和DRIP-qPCR分析，检测杂交体的动态变化。通过细胞存活实验（克隆形成实验）、同源重组/非同源末端连接(HR/NHEJ)修复效率报告系统以及膀胱癌(Bladder Cancer, BLCA)患者样本的免疫组化分析和小鼠异种移植瘤模型，评估了目标蛋白的生物学功能及治疗潜力。研究中涉及的人膀胱癌细胞系、临床样本队列（来自63名BLCA患者）和小鼠模型为结论的可靠性提供了支持。

IGF2BP2定位于DSB并促进DSB修复

研究人员首先通过siRNA筛选发现，在众多m⁶A阅读器中，敲低IGF2BP2会导致最显著的DNA损伤积累。进一步实验证实，过表达IGF2BP2能加速损伤修复，而敲低则使细胞对DNA损伤剂Zeocin敏感。利用I-Ppol系统诱导特定位点DSB，通过ChIP实验证实IGF2BP2能被招募至DSB处。免疫荧光显示，在DNA损伤后，原本主要位于细胞质的IGF2BP2会转移至细胞核，并与γH2AX焦点共定位。

IGF2BP2向DSB的定位依赖于m⁶A

作为m⁶A阅读器，IGF2BP2的功能是否依赖m⁶A？研究表明，敲低m⁶A甲基转移酶METTL3后，DSB处的m⁶A信号和IGF2BP2招募均显著减少。通过构建IGF2BP2的不同功能域截短体（KH1-2和KH3-4域），发现其识别m⁶A所必需的KH3-4域对于其向DSB位点的核转位及促进修复的功能至关重要。

DHX9被IGF2BP2招募至DSB位点并促进DNA修复

为了探究IGF2BP2的作用机制，研究人员通过质谱分析发现IGF2BP2与RNA解旋酶DHX9存在相互作用，并经Co-IP和PLA实验证实。功能上，敲低DHX9同样会导致DNA修复缺陷。重要的是，IGF2BP2的招募是DHX9定位到DSB位点的前提，且此过程依赖于IGF2BP2的KH3-4域。ChIP实验进一步证实IGF2BP2能促进DHX9在损伤位点的富集。

m⁶A-IGF2BP2-DHX9轴促进DSB处DNA-RNA杂交体的清除

DHX9已知具有消除DNA-RNA杂交体的功能。本研究通过S9.6抗体免疫荧光和DRIP-qPCR分析发现，在DSB形成后，DNA-RNA杂交体会先积累而后被清除。敲低IGF2BP2或DHX9会导致杂交体在DSB处异常积聚。反之，过表达IGF2BP2-WT或KH1-2域（而非KH3-4域）能促进杂交体的清除。这些效应均对RNase H（能特异性降解DNA-RNA杂交体中的RNA链）敏感，证实了所检测信号的特异性。

IGF2BP2促进RAD51装载和HR介导的DSB修复

成功的HR修复需要RAD51在单链DNA上形成核蛋白丝。研究发现，在DNA-RNA杂交体被清除后，RAD51才开始在DSB位点富集。敲低IGF2BP2或DHX9会显著抑制RAD51焦点的形成。而过表达IGF2BP2-WT或KH1-2域则能促进RAD51的招募。修复效率分析表明，抑制IGF2BP2或DHX9会损害HR修复，同时使细胞更倾向于使用容易出错的NHEJ通路进行修复，导致基因组不稳定性增加（如微核形成）。

IGF2BP2是癌症治疗的潜在靶点

通过对癌症基因组图谱(TCGA)数据和膀胱癌患者样本的分析，发现IGF2BP2在多种癌症（包括膀胱癌）中高表达，且与患者不良预后相关。体外实验表明，IGF2BP2抑制剂CWI1-2能增强膀胱癌细胞对 cisplatin（顺铂）的敏感性。在小鼠移植瘤模型中，联合使用CWI1-2和 cisplatin能显著抑制肿瘤生长，效果优于单药治疗，提示靶向IGF2BP2有望成为提高DNA损伤疗法疗效的新策略。

本研究揭示了DNA损伤修复中一个精细的时空调控机制：在HR修复早期，DNA-RNA杂交体的形成有助于启动修复；而在修复中后期，m⁶A修饰作为一种分子标记，招募IGF2BP2-DHX9复合物来及时清除这些杂交体，为RAD51的加载和完整的HR修复扫清障碍。这一“m⁶A-IGF2BP2-DHX9”轴确保了修复过程的顺利进行。研究不仅阐明了IGF2BP2这一主要定位于细胞质的m⁶A阅读器在细胞核内的新功能，也解释了m⁶A修饰在DNA-RNA杂交体动态调控中看似矛盾的双重作用——其效应取决于被何种阅读器蛋白在特定时空背景下识别。更重要的是，该研究将基础分子机制与临床转化潜力紧密结合，证明靶向IGF2BP2能够特异性地削弱癌细胞的DNA修复能力，使其对常规化疗更为敏感，为克服肿瘤治疗耐药性提供了新的理论依据和潜在的联合治疗靶点。