REV-ERB核受体通过抑制Npas2维持正常昼夜节律周期长度的机制研究

《Cell Reports》：Normal circadian period length requires repression of Npas2 by REV-ERB nuclear receptors

为解决REVERB核受体缺失导致昼夜节律周期缩短的机制问题，研究人员开展REVERB调控NPAS2/CLOCK通路的研究，发现REVERB DKO通过解除对Npas2和Clock的转录抑制显著缩短SCN和肝脏的自主节律周期，并导致肝脏节律去同步化。该研究揭示了REVERB在维持核心时钟稳定性中的关键作用，为代谢性昼夜节律疾病提供新靶点。

　　

生物体的昼夜节律是由内在的分子时钟调控的，这个精密系统帮助机体预测并适应外界环境的昼夜变化。在哺乳动物中，核心的昼夜节律机制依赖于一个转录翻译反馈环（TTFL），其中CLOCK（或NPAS2）与BMAL1形成的异二聚体激活Period（Per）和Cryptochrome（Cry）等基因的表达，随后PER和CRY蛋白反馈抑制自身的转录。REV-ERB核受体（包括α和β亚型）是该环路中的重要转录抑制因子，通过直接抑制Arntl（编码BMAL1）、Npas2和Clock等基因参与节律调控。然而，REV-ERB完全缺失（REV-ERB DKO）会导致自由运转节律周期显著缩短，但具体机制及其在不同组织中的一致性尚不明确。

为了深入探索REV-ERB调控节律周期的细胞自主性、跨组织保守性以及分子机制，Michael C. Tackenberg等研究人员在《Cell Reports》上发表了最新研究成果。他们利用器官型切片培养、实时生物发光记录、基因表达分析和病毒介导的基因操控等多种技术，首次揭示REV-ERB通过直接抑制时钟转录因子NPAS2和CLOCK以维持近24小时的正常节律周期。

本研究主要采用以下关键技术方法：

1. 1.
   使用器官型脑视交叉上核（SCN）和肝脏切片培养模型，在体外诱导REV-ERB双敲除（DKO），并利用PER2::LUC报告系统实时记录节律变化；
2. 2.
   通过腺相关病毒（AAV）介导的Cre重组酶实现组织特异性基因敲除，并应用shRNA knockdown及过表达技术靶向Npas2、Clock和Arntl等基因；
3. 3.
   采用实时生物发光成像和钙信号记录分析节律振幅、周期及相位同步性；
4. 4.
   利用qPCR和重新分析已发表的RNA-seq数据验证基因表达变化。

研究结果

Maintenance of normal SCN period length by REV-ERBs is cell autonomous

通过在SCN切片中直接诱导REV-ERB DKO，研究人员发现其自由运转周期显著缩短（约21.7小时），与体内观察到的表型一致，表明该效应是细胞自主性的，并不依赖于网络层面的环境或授时因子影响。

REV-ERB DKO shortens the period of the liver PER2 rhythm

在肝脏中，通过尾静脉注射AAV-TBG-Cre诱导肝细胞特异性REV-ERB敲除后，体外培养的肝脏切片同样表现出节律周期缩短（约21.9小时），说明REV-ERB调控节律周期的功能在中央时钟SCN和外围肝脏组织中均保守。

Tissue-specific effects of loss of REV-ERBs on the molecular clock

尽管周期缩短现象在SCN和肝脏中一致，但振幅变化呈现组织特异性：SCN中PER2::LUC节律振幅显著增加，而肝脏中振幅则在初期正常之后迅速衰减。进一步通过显微成像分析发现，REV-ERB DKO肝脏切片的节律细胞相位分布广泛分散，表明细胞内同步性丧失可能是振幅衰减的主因。

Loss of REV-ERBs leads to upregulation of target genes in SCN and liver

基因表达分析显示，在REV-ERB DKO的SCN和肝脏中，已知靶基因Npas2和Arntl表达均显著上升，其中Npas2的上调尤为明显。此外，肝脏中Clock表达也明显升高，说明REV-ERB缺失解除了对这些核心时钟基因的转录抑制。

Direct repression of clock gene Npas2 by REV-ERBs is required to maintain the nearly 24 h period

为阐明周期缩短的机制，研究人员排除了PER2蛋白稳定性改变或Casein kinase 1ε（CK1ε）通路参与的可能性。通过shRNA同时敲低Npas2和Clock可成功挽救REV-ERB DKO SCN中的短周期表型，将其恢复至接近正常周期（约23.7小时），而过表达NPAS2和CLOCK则足以缩短正常SCN的节律周期。这些结果表明，REV-ERB通过抑制Npas2和Clock的表达以维持正常近24小时节律。

讨论与结论

该研究确立了REV-ERB核受体在维持昼夜节律周期中的核心作用，其机制是通过直接抑制时钟基因Npas2和Clock的表达实现。这一调控机制在SCN和肝脏中均具有细胞自主性和保守性。值得注意的是，REV-ERB缺失对节律振幅和同步性的影响具有组织特异性：耦合较强的SCN网络能抵抗振幅衰减，而耦合较弱的肝脏则易出现节律去同步化和振幅下降。

这些发现不仅深化了对生物钟分子机制的理解，也为REV-ERB在代谢与节律交叉调控中的角色提供了新见解。由于REV-ERB DKO肝脏仍具备节律能力但周期异常，这种内在外周节律与中枢节律之间的失调可能是代谢疾病发生的重要因素。该研究强调，靶向REV-ERB–NPAS2/CLOCK通路有望为昼夜节律相关代谢性疾病提供新的治疗策略。