TCP15-HDA4模块通过促进生长素合成与信号转导介导温暖温度抑制番茄侧芽生长的表观遗传机制

《Molecular Plant》：Warm temperature activates the TCP15-HDA4 module to suppress shoot branching through promoting auxin biosynthesis and signaling in tomato

本研究针对全球变暖背景下温度如何调控植物株型这一关键科学问题，聚焦番茄侧芽生长的温度响应机制。研究人员发现，温暖温度通过激活组蛋白去乙酰化酶SIHDA4，使其与转录因子SITCP15形成复合物，特异性降低光受体SIPHYB1和生长素信号抑制因子SIIAA12启动子区的H3K9ac水平，从而增强生长素合成与信号转导，最终抑制侧芽生长。该研究首次揭示了温度信号通过表观遗传修饰精细调控植物分枝的分子通路，为作物株型改良提供了新靶点。

　　

在全球气候变暖的背景下，环境温度对作物生长发育的影响日益凸显。温度每升高1°C，作物产量可能下降高达10%。植物无法像动物一样自由移动来躲避不良环境，其应对温度变化的适应性机制尤为重要。株型结构，特别是分枝（侧芽生长）特性，是决定作物产量的关键农艺性状之一。番茄作为世界性的重要蔬菜作物，其株型调控直接关系到栽培管理的便利性和果实产量。然而，温暖温度如何影响番茄侧芽生长的内在分子机制，尤其是表观遗传层面如何介导这一过程，此前尚不明确。

以往研究表明，侧芽的生长受到植物激素（如生长素、细胞分裂素）和糖信号等的精密调控。生长素在主干顶端的极性运输被认为可以抑制侧芽的生长。同时，光信号（如光敏色素PHYB感知的红光/远红光比例）和温度信号之间存在复杂的交叉对话。例如，在拟南芥中，高温可通过PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4 (PIF4) 促进生长素合成，进而影响下胚轴伸长。但温度信号是否以及如何通过表观遗传修饰来调控侧芽生长，仍是一个有待探索的前沿领域。表观遗传修饰，特别是组蛋白乙酰化，通过组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的动态平衡，在调节基因转录以响应环境信号（如光和温度）中扮演关键角色。组蛋白乙酰化（如H3K9ac）通常与基因激活相关，因为其导致染色质结构变得松散。有证据表明，表观遗传调控因子介导季节性温度变化以控制芽的休眠，因此研究者提出假设：温度响应的组蛋白去乙酰化酶可能通过直接修饰关键发育基因的染色质状态来调控侧芽生长，从而将环境感知与植株结构可塑性联系起来。

为了回答上述问题，研究人员在《Molecular Plant》上发表了题为“Warm temperature activates the TCP15-HDA4 module to suppress shoot branching through promoting auxin biosynthesis and signaling in tomato”的研究论文。该研究旨在揭示温暖温度抑制番茄侧芽生长的表观遗传机制。

本研究主要应用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建突变体、病毒诱导的基因沉默（VIGS）、转录组测序（RNA-seq）、酵母双杂交（Y2H）筛选、免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补（BiFC）验证蛋白互作、染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR分析组蛋白修饰、凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）验证DNA-蛋白结合、双荧光素酶报告基因检测（dual-LUC）分析转录调控以及植物激素（生长素IAA）含量测定等关键技术方法。实验材料主要为番茄栽培种（Solanum lycopersicum）的野生型、突变体和转基因株系。

Establishment of a model system for studying temperature control of lateral bud outgrowth

研究人员首先建立了研究温度调控侧芽生长的模型系统。他们将番茄植株置于23°C、27°C和30°C（番茄生长的适宜温度范围）下培养，发现随着温度升高，植株高度和节间长度增加，但地上部生物量下降。更重要的是，侧芽的总长度随温度升高而显著减少，同时侧芽中分枝抑制关键基因SIBRC1的表达上调。由于30°C时表型更为显著，后续实验主要在此温度下进行。利用SIBRC1启动子驱动GUS报告基因的植株，证实了30°C下侧芽中SIBRC1的表达增强。进一步分析发现，温暖温度显著促进了主茎顶端（MSA）的生长素（IAA）积累，并上调了生长素生物合成限速酶基因SIFZY1（番茄YUC4同源物）的表达。去顶实验表明，在30°C下去顶并不能有效降低节间茎秆中的IAA含量，也不能完全逆转侧芽生长的抑制。而利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术降低SIFZY1的表达，则能有效缓解高温对侧芽生长的抑制。这些结果初步表明，生长素生物合成和信号转导在温暖温度抑制侧芽生长过程中起着关键作用。

The temperature-responsive SIHDA4 repressed tomato lateral bud outgrowth

接着，研究者关注了表观遗传修饰在其中的作用。他们发现，在30°C下，侧芽中组蛋白H3的整体乙酰化水平（H3ac）显著降低，而H4ac水平不变。对组蛋白去乙酰化酶家族基因的表达分析显示，SIHDA4基因在高温下于主茎顶端和侧芽中诱导表达最为显著。通过CRISPR/Cas9技术构建了slhda4突变体，并获得了SIHDA4过表达（OE-SIHDA4）株系。表型分析发现，slhda4突变体侧芽生长显著增强，而OE-SIHDA4株系侧芽生长则受到抑制。互补实验（在slhda4背景中过表达SIHDA4）可以回补突变体的表型。原位杂交和qPCR结果证实，SIHDA4正向调控SIBRC1的表达。进一步分析组蛋白乙酰化状态发现，SIHDA4主要作用于降低H3K9位点的乙酰化（H3K9ac）。在高温下，野生型侧芽中H3K9ac水平显著降低，而这一效应在slhda4突变体中被削弱。更重要的是，slhda4突变体的侧芽生长及其SIBRC1表达对高温的响应减弱。这些结果表明，SIHDA4参与了高温抑制侧芽生长的过程。

Involvement of auxin response in SIHDA4-mediated regulation of lateral bud outgrowth under elevated temperature

为了深入理解SIHDA4的作用机制，研究者对野生型和slhda4突变体进行了转录组测序（RNA-seq）。分析发现，在slhda4突变体中，许多在野生型中受高温诱导表达的基因（特别是植物激素信号转导相关基因）其响应程度减弱。外源施加生长素类似物NAA可以抑制slhda4突变体增强的侧芽生长，但在OE-SIHDA4株系中，NAA的抑制效应相对较弱。在OE-SIHDA4背景中沉默SIFZY1或进行去顶处理，均能促进侧芽生长。激素测定显示，slhda4突变体主茎顶端的IAA含量显著低于野生型，而OE-SIHDA4株系则更高。并且，slhda4突变体主茎顶端的IAA含量和SIFZY1表达对温度升高不再敏感。这些数据表明，SIHDA4通过影响生长素响应来调控侧芽生长。

SIHDA4 regulated the expression of SIPHYB1 and SIIAA12 through decreasing the histone acetylation at their gene promoters

既然HDACs通常抑制基因转录，那么SIHDA4介导的生长素水平升高可能是通过抑制生长素信号转导的负调控因子来实现的。通过交叉分析转录组数据，研究者筛选出两个候选基因：光敏色素基因SIPHYB1和生长素信号抑制因子基因SIIAA12（属于AUX/IAA家族）。qPCR验证表明，在野生型中，高温抑制了SIPHYB1和SIIAA12的表达，而这种抑制效应在slhda4突变体中减弱。利用OE-SIHDA4（携带HA标签）植株进行ChIP-qPCR实验，发现SIHDA4-HA蛋白能够结合到SIPHYB1和SIIAA12的启动子区域，且高温增强了这种结合。同时，使用H3K9ac抗体进行的ChIP-qPCR显示，高温降低了野生型中这两个基因启动子区的H3K9ac水平，而slhda4突变体在常温和高温下均保持较高的H3K9ac水平。功能实验表明，slphyb1突变或沉默SIIAA12均能抑制侧芽生长并上调SIBRC1表达，且它们对高温的响应减弱。更重要的是，在slhda4突变体背景中分别沉默SIPHYB1或SIIAA12，能够部分回补slhda4突变体增强的侧芽生长表型，并上调SIBRC1表达。这些结果说明，SIHDA4通过降低SIPHYB1和SIIAA12启动子区的H3K9ac水平来抑制其转录，从而抑制侧芽生长。

SIHDA4 functioned together with SITCP15 to regulate auxin level and signaling and lateral bud outgrowth

组蛋白去乙酰化酶通常需要特定的“阅读器”或转录因子将其招募到染色质特定位置。通过酵母双杂交（Y2H）筛选，研究者发现转录因子SITCP15与SIHDA4存在强烈的物理相互作用。GST Pull-down、Co-IP和BiFC实验进一步证实了它们在体内外的互作。表型分析显示，沉默SITCP15会导致侧芽生长增强，而其同源物SITCP14的沉默则无明显效应。虽然SITCP15的转录本对高温响应不明显，但其蛋白水平在烟草瞬时表达系统中受高温诱导。在OE-SIHDA4背景中沉默SITCP15，可以逆转OE-SIHDA4对侧芽生长的抑制效应，并伴随主茎顶端IAA含量的下降以及SIPHYB1和SIIAA12表达的上升。这表明SIHDA4的功能依赖于SITCP15。

SITCP15 regulated the transcription of SIPHYB1 and SIIAA12 in concert with SIHDA4 under elevated temperature

为了研究SITCP15的功能，研究者构建了sltcp15 CRISPR/Cas9突变体。sltcp15突变体表现出侧芽生长增强，且对高温的响应减弱，其主茎顶端的IAA含量和SIFZY1表达对高温的敏感性也下降。转录组分析发现，SIPHYB1和SIIAA12同样是SITCP15的靶基因。qPCR证实，sltcp15突变体中SIPHYB1和SIIAA12表达受高温抑制的程度小于野生型。在sltcp15背景中沉默SIPHYB1或SIIAA12，能抑制其增强的侧芽生长。生物信息学分析在SIPHYB1和SIIAA12的启动子区发现了多个潜在的TCP结合位点（GTGGG motif）。EMSA实验证实SITCP15可以直接结合到SIPHYB1启动子的S1位点和SIIAA12启动子的S6位点。ChIP-qPCR显示，sltcp15突变体中SIPHYB1和SIIAA12启动子区的H3K9ac水平升高。双荧光素酶报告基因实验表明，SITCP15或SIHDA4单独表达均可抑制报告基因的转录，两者共表达则具有协同抑制效应。更重要的是，在sltcp15突变体背景中，SIHDA4结合到SIPHYB1和SIIAA12启动子的能力丧失，同时启动子区的H3K9ac水平在OE-SIHDA4/sltcp15植株中恢复到高水平，基因抑制也被解除。这些结果强有力地证明，SITCP15负责将SIHDA4招募到靶基因启动子特定位置，通过降低H3K9ac水平来协同抑制SIPHYB1和SIIAA12的转录。

讨论

本研究揭示了SIHDA4在响应温暖温度、通过促进生长素合成和信号转导来抑制番茄侧芽生长中的核心作用。研究发现，高温抑制侧芽生长与生长素生物合成增加相关，沉默SIFZY1能缓解高温的抑制效应，说明生长素通路至关重要。然而，去顶处理对茎节IAA含量和侧芽生长的逆转效果不如沉默SIFZY1明显，提示靠近芽的茎秆中的IAA水平可能与侧芽生长更直接相关。

研究观察到高温下侧芽整体组蛋白乙酰化水平降低，特别是H3K9ac。虽然slhda4突变体未能完全恢复高温下的H3K9ac水平（可能由于其他表观调控因子的存在），但其H3K9ac水平高于野生型，并且高温抑制侧芽生长的效应被消除，这确立了SIHDA4在温度调控侧芽生长中的关键地位。

番茄SIHDA4是拟南芥HDA9的同源物。本研究阐明了SIHDA4通过抑制生长素信号负调控因子SIIAA12和光信号受体SIPHYB1的表达来增强生长素反应的机制。ChIP-qPCR证实了SIHDA4介导的H3K9去乙酰化在高温抑制这两个基因表达中的必要性。沉默SIPHYB1或SIIAA12能减弱高温对侧芽生长的抑制，证实了该通路的重要性。PHYB1是光和温度的共同传感器，其转录水平受昼夜节律调控，而HDA9已知与节律钟组件互作，本研究提示SIHDA4介导的H3K9去乙酰化可能是调控SIPHYB1转录的新机制。活化的PHYB抑制PIF因子的功能，而PIFs直接激活生长素生物合成基因。因此，PIFs介导了PHYB依赖的光温响应通路。本研究发现在高温下，SIPIF3（PIF同源物）表达上调，且其在slhda4中的诱导被削弱，这与SIHDA4下调SIPHYB1从而可能解除对PIFs抑制的模型一致。SIIAA12作为生长素信号抑制因子，其表达下调直接促进了生长素信号转导。研究发现沉默SIIAA12后主茎顶端生长素生物合成增加，提示可能存在反馈调节。

在机制上，本研究揭示了SITCP15作为“阅读器”将SIHDA4招募到靶基因启动子的关键作用。SITCP15直接结合DNA，并与SIHDA4协同抑制转录和降低H3K9ac。在sltcp15突变体中，SIHDA4的招募和功能完全丧失，证明了SITCP15的必要性。TCP家族转录因子是植物形态建成的关键调控因子，近年来发现其参与环境响应。本研究发现的SITCP15-SIHDA4模块与拟南芥中TCP因子（如TCP14, TCP15）和HDA9在高温形态建成中的作用有相似之处，提示这类调控机制在作物中可能具有保守性。

结论

综上所述，本研究提出了一个温暖温度调控番茄侧芽生长的精细模型：在常温（23°C）下，SIHDA4维持基础水平，SIPHYB1和SIIAA12启动子区的H3K9ac水平得以维持，基因正常表达。当温度升高时，SIHDA4水平增加，并被SITCP15招募到SIPHYB1和SIIAA12的启动子特定区域。SIHDA4的组蛋白去乙酰化酶活性降低了这些启动子区的H3K9ac水平，抑制了SIPHYB1和SIIAA12的转录。SIPHYB1的下调可能解除了对PIF等生长促进因子的抑制，而SIIAA12的下调则直接增强了生长素信号响应，最终通过促进生长素合成和信号转导，抑制了侧芽的生长。该研究首次揭示了温度信号通过TCP15-HDA4转录-表观遗传复合模块调控植物分枝的分子机制，为理解环境温度塑造植物株型的机理提供了重要见解，也为通过调控表观遗传路径改良作物株型、应对气候变化提供了潜在的新策略。