转座子插入OsPT1基因5'非翻译区重构表达模式导致水稻籽粒镉高积累的机制研究

《Plant Communications》：A transposon insertion into the 5’ UTR of OsPT1 reprograms its expression pattern and leads to high cadmium accumulation in rice grains

本研究针对水稻籽粒镉(Cd)污染这一重大食品安全问题，通过全基因组关联分析(GWAS)鉴定到29个籽粒镉含量相关位点(LAGCCs)。研究人员发现OsPT1基因5'UTR区Harbinger型微型反向重复转座元件(H-MITE)的插入，在转录因子OsbHLH35介导下重构了OsPT1的表达模式，导致镉胁迫下表达显著激活，进而通过扰乱离子稳态间接促进籽粒镉积累。利用CRISPR/Cas9技术敲除OsPT1、OsbHLH35或编辑H-MITE插入位点，可显著降低籽粒镉含量61.7%-80.6%，为培育低镉水稻品种提供了新靶点。

　　

餐桌上的米饭，作为全球近半数人口的主食，其安全性关乎亿万民众的健康。然而，随着工业、采矿活动以及污水灌溉和化肥使用的增加，农田土壤普遍受到重金属镉(Cd)的污染。水稻作为一种容易从土壤中吸收并积累镉的作物，其籽粒中的镉含量超标问题日益严峻。镉通过食物链进入人体后，会引发“痛痛病”等严重健康问题，对肾脏和骨骼造成不可逆的损害。因此，揭示水稻籽粒镉高积累的遗传基础，并培育低镉积累的水稻品种，是保障粮食安全和公众健康的迫切需求。

以往的研究虽然已经鉴定出一些与镉吸收和转运相关的基因，例如OsNRAMP5、OsHMA3等，但水稻籽粒镉积累的分子遗传机制仍未完全阐明。不同水稻品种，特别是籼稻(IND)和粳稻(TEJ、TRJ)亚种之间，籽粒镉含量存在显著差异，这暗示着其背后存在着复杂的遗传调控网络。为了系统解析这一复杂性状，研究人员在《Plant Communications》上发表了他们的最新成果。

为开展此项研究，作者运用了多项关键技术。他们首先对水稻多样性群体1号(RDP1)的310份种质资源进行了田间表型鉴定，在镉污染大田环境中测量了早、晚两季的籽粒镉含量(GCC)。随后，利用高密度水稻芯片(HDRA)获得的约70万个单核苷酸多态性(SNP)数据进行全基因组关联分析(GWAS)。在候选基因验证阶段，结合了Sanger测序、单倍型分析以及基于3,000份水稻基因组(3K-RG)数据的转座子插入多态性分析。功能研究方面，采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术创制突变体，通过农杆菌介导的遗传转化获得过表达和启动子-报告基因(如GUS)转基因植株。分子机制探索则涉及5'RACE、蛋白质-DNA互作分析(EMSA、酵母单杂交Y1H)、转录调控活性检测(原生质体瞬时表达、双荧光素酶报告基因试验)以及电感耦合等离子体光谱(ICP-OES)测定金属元素含量等方法。

变异丰富的水稻籽粒镉含量

研究人员在镉污染田间种植了RDP1群体的310份水稻材料，并成功测定了其中269份(早季)和278份(晚季)的籽粒镉含量。数据显示，籽粒镉含量呈现偏态分布，晚季籼稻的平均镉含量最高，而温带粳稻和热带粳稻的镉含量相对较低，这与前人研究结果一致。相关性分析表明，籽粒镉含量与生长周期无显著关联，但镉胁迫明显影响了水稻的分蘖数等农艺性状。这些丰富的表型变异为后续遗传解析奠定了坚实基础。

GWAS鉴定出29个籽粒镉含量相关位点

通过对70万个SNP进行全基因组关联分析，研究共鉴定出157个与籽粒镉含量显著相关的SNP，进一步归并后得到29个非冗余的籽粒镉含量相关位点(LAGCCs)。这些位点能够解释相当大比例的表型变异。值得注意的是，其中有11个位点与已克隆的镉积累相关基因或已定位的数量性状位点(QTL)共定位，例如LAGCC1与OsCLT1重叠，LAGCC16与OsNRAMP5重叠。同时，有18个位点是本研究新发现的。

转运蛋白基因OsPT1与籽粒镉含量相关

研究人员将目光聚焦于位于第3号染色体上、且未与已知基因重叠的LAGCC3和LAGCC4区域。通过对该区域内候选转运蛋白基因进行测序分析，发现OsPT1（一种磷酸盐转运蛋白）启动子区的多态性与籽粒镉含量紧密相关。特别是在93-11等籼稻品种中，OsPT1基因转录起始位点(TSS)上游354 bp处存在一个266 bp的插入，而粳稻品种日本晴(NPB)中则缺失该插入。单倍型分析将RDP1种质分为不含此插入的单倍型A和含此插入的单倍型B。携带单倍型B的水稻材料其中位籽粒镉含量显著高于单倍型A。连续多年的田间试验进一步验证了这种基因型-表型关联的稳定性。跨亚种分析表明，无论籼稻还是粳稻背景，携带该插入的材料的平均籽粒镉含量均显著高于不携带的材料，证实了该H-MITE插入是导致籽粒镉含量升高的关键因素。

266 bp插入序列为H-MITE且在籼稻中广泛分布

序列分析证实，该266 bp的插入是一个Harbinger型微型反向重复转座元件(H-MITE)。对独立的3K-RG群体分析发现，该插入在籼稻中几乎普遍存在(98.3%)，而在粳稻中非常罕见(2.2%)。地理分布分析显示，不含H-MITE插入的单倍型A主要分布在美国、日本、欧洲和部分非洲国家，而携带插入的单倍型B则集中在中国、印度和东南亚等主要水稻产区，这提示许多发展中国家种植的水稻品种可能存在较高的镉积累风险。

H-MITE插入改变OsPT1基因结构和表达模式

5'RACE实验表明，H-MITE的插入改变了OsPT1的5'非翻译区(UTR)和转录起始位点，形成了一个包含54 bp H-MITE片段和354 bp原始5'UTR序列的新颖5'UTR。表达分析发现，在正常条件下，93-11中的OsPT1转录本丰度低于NPB；但在镉胁迫下，93-11中的OsPT1表达被强烈诱导，而NPB中则无明显变化。启动子活性分析进一步证实，含有H-MITE插入的启动子(ProOsPT1^H-MITE)在镉胁迫下能在多个水稻组织中驱动GUS报告基因显著上调，而不含插入的启动子(ProOsPT1)则无此效应。这表明H-MITE插入重构了OsPT1在镉胁迫下的表达模式。

H-MITE插入导致水稻镉高积累

功能获得和功能缺失实验验证了OsPT1在镉积累中的作用。在NPB背景中过表达OsPT1，导致水稻幼苗根和地上部在镉胁迫下积累更多镉，籽粒镉含量也显著升高；相反，敲除OsPT1的突变体(ospt1)则表现出更低的镉积累。此外，OsPT1过表达植株出现矮化、穗长和千粒重降低等表型，而ospt1突变体农艺性状正常。

转录因子OsbHLH35结合并调控OsPT1^H-MITE的转录

为了解H-MITE介导的镉诱导表达的分子机制，研究人员利用DNA pull-down结合质谱技术，鉴定出特异性结合ProOsPT1^H-MITE的转录因子OsbHLH35。EMSA实验证实OsbHLH35能直接且更强地结合ProOsPT1^H-MITE，并在H-MITE片段内鉴定出两个关键结合位点(BS1: GCACCCGC; BS2: CCTACTTGG)。转录调控活性分析表明，OsbHLH35能显著激活由ProOsPT1^H-MITE驱动的报告基因表达，而这种激活效应在缺失BS1或BS2后减弱，双位点缺失后则完全消失。在镉胁迫下，敲除OsbHLH35会导致OsPT1^H-MITE的诱导表达显著减弱。这些结果证实OsbHLH35是介导镉胁迫下OsPT1^H-MITE转录激活的关键因子。

敲除OsPT1和OsbHLH35或靶向编辑H-MITE显著降低水稻籽粒镉含量

在高镉积累的籼稻品种93-11背景中，利用CRISPR/Cas9技术敲除OsPT1或OsbHLH35，以及靶向删除H-MITE序列，均能显著降低籽粒镉含量，降低幅度达61.7%至80.6%。双敲突变体(ospt1-osbhlh35)的籽粒镉含量甚至低于单突变体。重要的是，这些基因编辑材料在主要农艺性状上与野生型无明显差异，显示出良好的应用潜力。

OsPT1影响镉积累的潜在机制

酵母实验表明OsPT1可能不直接转运镉。研究人员推测其作用可能与磷酸盐(Pi)和铁(Fe)的拮抗作用有关。体外实验证实磷酸根离子能与Fe²⁺快速结合形成沉淀。表达分析显示，OsPT1过表达植株中铁缺陷标记基因(OsTOM1, OsNAAT1)以及多个铁/镉(如OsNRAMP1, OsIRT2, OsYSL2, OsYSL15, OsIRT1)、锰/镉(如OsNRAMP5)共转运蛋白基因显著上调，且植株体内铁含量发生变化。这表明OsPT1过表达可能通过扰乱磷酸盐稳态，诱发类似铁饥饿的反应，进而上调金属共转运蛋白基因的表达，间接导致镉积累增加。

本研究揭示了一个由转座子插入驱动的、调控水稻籽粒镉积累的新机制。H-MITE插入OsPT1基因5'UTR，在转录因子OsbHLH35的介导下，重构了该基因的表达模式，使其对镉胁迫产生强烈响应。OsPT1表达的异常升高，可能通过干扰细胞内磷酸盐和铁等元素的稳态，间接激活一系列镉吸收和转运相关基因，最终导致籽粒镉的高积累。这一发现不仅深化了我们对植物响应重金属胁迫分子机制的理解，更重要的是，通过基因编辑技术靶向修饰OsPT1、OsbHLH35或H-MITE插入位点，能够有效降低水稻籽粒镉含量，且不影响农艺性状，为通过分子育种手段培育低镉安全水稻品种提供了极具应用前景的新策略和新靶点，对保障粮食安全和公众健康具有重要意义。