基于生物素-链霉亲和素相互作用的高质量单链DNA制备技术：推动重组腺相关病毒基因组标准品开发与应用

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Generation of high-quality single-stranded DNA for full-length and truncated genome standards of recombinant adeno-associated viruses

本研究针对重组腺相关病毒(rAAV)基因治疗中单链DNA(ssDNA)基因组完整性分析的瓶颈，开发了一种基于质粒线性化、生物素化dNTPs末端填充与链霉亲和素磁珠分离的新型ssDNA制备方法。该方法可在一天内高效生成全长及截断型rAAV ssDNA标准品，经双链合成与长读长测序验证具备高纯度与准确性，为rAAV载体质量控制的分析方法开发提供了关键工具。

　　

在基因治疗领域，重组腺相关病毒(rAAV)因其低致病性和高效转导非分裂细胞的特性，已成为最具前景的载体之一。然而，rAAV产品的质量控制面临严峻挑战：其携带的单链DNA(ssDNA)基因组长度可达4.7 kilobases (kb)，且两端含有易形成复杂二级结构的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeats, ITRs)。基因组在包装过程中可能发生突变、截断或重排，直接影响治疗产品的有效性与安全性。当前，监测ssDNA完整性的分析方法（如长读长测序、多重PCR）缺乏高纯度、结构准确的标准品，严重制约了技术开发与标准化进程。

为解决这一难题，Roche Diagnostics GmbH的Julia Manz团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表研究，开发了一种不依赖病毒生产的ssDNA标准品制备新策略。该方法以含rAAV基因组的质粒(pITR)为起点，通过限制性内切酶线性化、Klenow片段介导的生物素化dNTPs末端填充、链霉亲和素磁珠捕获、双酶切去除质粒骨架及碱性链分离等关键步骤，高效获得高纯度ssDNA。研究通过双链合成与单分子实时(SMRT)测序验证了产物的长度准确性与序列一致性，并成功应用于截断基因组的模拟制备，为rAAV分析方法的开发与验证提供了可靠工具。

关键技术方法

研究以实验室构建的pITR1(6,634 bp，含4,565 bp rAAV基因组)和pITR2为原料，通过PaqCI线性化质粒，利用Klenow片段(3'→5' exo-)在粘性末端填充生物素标记的dATP/dCTP，经ProNex磁珠纯化后与链霉亲和素磁珠结合。通过StuI/PacI双酶切去除质粒骨架，氢氧化钠(NaOH)解离非生物素化链获得ssDNA。产物通过Qubit ssDNA检测试剂盒定量，Fragment Analyzer 5300进行片段分析，Bst 3.0聚合酶介导的双链合成及PacBio Sequel IIe平台SMRT测序验证完整性。

结果

Development of a method to produce rAAV ssDNA based on biotin-streptavidin interaction

初期采用生物素化发夹适配体连接策略时，因ITR二级结构干扰连接效率，产物中混杂大量双链DNA(dsDNA)。优化后通过直接填充生物素化dNTPs，在单分子末端引入多个生物素标签，显著增强链霉亲和素结合稳定性，碱性解离后仅见单一ssDNA条带。

Concentration and size evaluation of the produced rAAV ssDNA

9次制备实验显示ssDNA回收率中位值为34%，Fragment Analyzer检测显示线性化质粒(A1)、骨架片段(A2)及ssDNA(A3)条带符合预期长度。使用pITR2验证方法通用性，回收率达31%，证实策略可适配不同质粒体系。

Verification of the generated ssDNA by double-strand synthesis and NGS

以3' ITR为引物进行双链合成后，产物主要条带与rAAV dsDNA预期长度(4,565 bp)一致，SMRT测序显示98.1%的读长匹配rAAV基因组序列，覆盖均匀且无共识序列突变。读长分布峰值约9 kb（为基因组长度的2倍），符合单端接头连接文库特征。

Production of truncated rAAV genomes

将StuI替换为基因组内切酶(EcoRI或HindIII)后，成功获得长度分别为2,714 bp和3,343 bp的截断ssDNA，双链合成验证条带准确，证明方法可灵活模拟不同截断类型的rAAV基因组。

讨论

本研究突破了长链ssDNA制备的技术壁垒，通过生物素-链霉亲和素系统实现了ITR结构复杂基因组的高效分离。回收率受末端填充效率影响，但纯度显著优于酶切链分离策略。双链合成中的副产物（如条带拖尾）可能与Bst 3.0聚合酶的链置换活性相关，而非ssDNA本身异质性。所制备的ssDNA标准品可应用于qPCR/ddPCR定量校准、截断基因组效应评估及体外衣壳包装研究，为rAAV药物的质量控制与工艺优化提供了关键技术支持。