基于多组学整合坏死性凋亡与免疫微环境特征构建NecropImmScore预测卵巢癌预后与治疗反应

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Integrating necroptosis and immune landscapes: a multi-omics-derived NecropImmScore stratifies prognosis and therapy in ovarian cancer

本研究针对卵巢癌(OC)免疫抑制性肿瘤微环境(TME)和治疗抵抗的临床难题，通过多组学分析和体外功能验证，揭示了MLKL驱动的坏死性凋亡通过诱导关键趋化因子(CXCL9/10/11/13)重塑TME、促进M1巨噬细胞极化和T细胞活化的重要机制。研究人员构建了新型坏死性凋亡-免疫标志物NecropImmScore，该评分可有效预测OC患者预后、免疫治疗反应、BRCA1突变状态及化疗敏感性，为OC精准治疗提供了创新性生物标志物。

　　

卵巢癌(OC)作为妇科恶性肿瘤中死亡率最高的癌种，其治疗困境主要源于晚期诊断、化疗耐药以及高度免疫抑制的肿瘤微环境(TME)。尽管手术联合铂类-紫杉醇化疗是标准方案，但晚期患者5年生存率仍徘徊在20-30%。免疫检查点抑制剂(ICB)在其他癌种中取得的突破性进展，在卵巢癌中却收效甚微，根源在于其"冷肿瘤"特性——T细胞浸润不足、免疫抑制细胞(Tregs, MDSCs)占主导、抗原呈递功能缺陷。因此，探寻能够逆转免疫抑制、激活抗肿瘤免疫的关键分子机制，成为改善卵巢癌预后的重中之重。

近年来，超越传统凋亡的调节性细胞死亡(RCD)方式，特别是坏死性凋亡(necroptosis)，因其潜在的免疫原性特征而备受关注。坏死性凋亡由RIPK1-RIPK3-MLKL信号轴介导，其终末效应蛋白MLKL在活化后发生磷酸化、寡聚化并易位至细胞膜，执行膜穿孔。这一裂解性死亡过程会释放损伤相关分子模式(DAMPs)，如HMGB1、ATP等，作为"内源性佐剂"激活抗原呈递细胞(APCs)，可能诱发免疫原性细胞死亡(ICD)，从而连接天然免疫与适应性T细胞免疫。然而，MLKL介导的坏死性凋亡信号如何精确整合进卵巢癌复杂的适应性免疫环路，其最终是促进肿瘤进展还是激发免疫监视，仍是一个悬而未决的关键科学问题。

为了回答上述问题，徐芳芳、康淑峰及徐少华等研究人员在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上发表了题为"Integrating necroptosis and immune landscapes: a multi-omics-derived NecropImmScore stratifies prognosis and therapy in ovarian cancer"的研究论文。该研究综合利用TCGA-OV(n=380)、ICGC OV-AU和IMvigor210队列的多组学数据（转录组、基因组、临床数据），并结合卵巢癌细胞系(SKOV3, HEY)、巨噬细胞(THP-1来源)和T细胞(Jurkat)的体外功能验证实验，系统探讨了MLKL在卵巢癌免疫微环境中的作用，并开发了一个全新的预后和治疗预测标志物。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：利用ESTIMATE、CIBERSORT和ssGSEA等计算免疫学方法量化肿瘤免疫浸润；通过差异表达基因(DEGs)分析、基因集富集分析(GSEA)和功能注释（GO/KEGG）揭示MLKL相关基因的生物学功能；采用共识聚类和主成分分析(PCA)对预后相关基因进行分子分型并构建NecropImmScore；通过MAFTOOLS分析体细胞突变和肿瘤突变负荷(TMB)，并计算同源重组缺陷(HRD)评分；利用pRRophetic和CellMiner数据库预测药物敏感性；并通过体外细胞共培养、实时定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹(WB)实验进行机制验证。

MLKL emerged as a central prognostic biomarker in OC via integrated necroptosis pathway analysis

通过整合坏死性凋亡通路分析，研究人员首先构建了蛋白质相互作用(PPI)网络，并结合单变量Cox回归(uniCox)分析发现，在17个坏死性凋亡相关基因中，MLKL和ZBP1是卵巢癌的显著保护性预后因素。MLKL的高风险比(HR)为0.812 (p=0.036)。进一步分析确定MLKL是连接坏死性凋亡信号与生存结局的关键节点。Kaplan-Meier生存分析证实，MLKL高表达患者的总生存期显著优于低表达患者(p=0.018)。泛癌分析显示，MLKL在多数癌症（包括卵巢癌）中扮演保护性角色，其表达在癌组织中显著低于正常组织。

MLKL reprogrammed the tumor-immune microenvironment and predicted immunotherapy response of OC patients

为了探究MLKL在卵巢癌TME中的作用，研究发现MLKL表达与ESTIMATE算法计算的ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore均呈极显著正相关(p<2.22e-16)，表明MLKL与肿瘤内免疫和基质成分的丰度密切相关。CIBERSORT分析显示，MLKL高表达与M1巨噬细胞(p=0.006)和活化的记忆性CD4⁺ T细胞(p=0.003)浸润增加显著相关。ssGSEA结果进一步支持MLKL在免疫相关通路激活中的作用。体外共培养实验证实，过表达MLKL的卵巢癌细胞能够促进巨噬细胞向M0和M1表型极化(p<0.05)，并增强Jurkat T细胞的活化（趋化因子受体CCR4/5/7/9及活化标志物CD69、CD3D/E、GZMB表达上调）。此外，MLKL高表达与关键免疫检查点分子（PD-L1、CTLA4、LAG3、TIGIT等）的表达上调相关，且在IMvigor210队列中，高MLKL表达与"炎症型"免疫表型和更高的免疫表型评分(IPS)相关，预示其对免疫检查点阻断疗法(ICB)有更好的反应。

MLKL drove chemokine-mediated immune cell recruitment to shape an anti-tumor microenvironment in OC

机制探索方面，GSEA分析提示MLKL表达富集于趋化因子信号通路。PPI网络分析鉴定出CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13这一趋化因子簇是MLKL相关核心分子。uniCox分析表明，这些趋化因子高表达与患者更好的生存预后相关。相关性分析显示，它们与M1巨噬细胞和CD8⁺ T细胞浸润呈正相关。体外功能验证发现，MLKL过表达的卵巢癌细胞条件培养基能显著上调共培养的M0/M1巨噬细胞和Jurkat T细胞中CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的表达。这表明MLKL通过诱导关键趋化因子，驱动免疫效应细胞向肿瘤微环境募集，从而塑造抗肿瘤免疫微环境。

Identification of MLKL-associated immune DEGs underpinning anti-tumor immunity in OC patients

通过差异表达分析，研究比较了MLKL高/低表达组和ImmuneScore高/低组，筛选出632个MLKL相关的免疫差异表达基因。功能富集分析显示，这些基因显著富集于T细胞活化、趋化因子信号通路、抗原加工与呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用等关键免疫学过程，从基因组层面揭示了MLKL调控抗肿瘤免疫的潜在分子基础。

Molecular stratification based on necroptosis-immune signatures revealed distinct prognostic and microenvironmental phenotypes in OC

研究人员对上述632个基因进行uniCox分析，筛选出102个与生存相关的基因。基于这102个基因进行共识聚类分析，将卵巢癌患者划分为三个分子亚型（Cluster A-C）。生存分析显示，三组间总生存期存在显著差异(log-rank p=0.019)，Cluster C预后最好，Cluster A最差。表达分析表明，Cluster C具有最高的MLKL表达水平、最活跃的坏死性凋亡通路活性以及最高的ImmuneScore。免疫浸润分析进一步证实，Cluster C的总体免疫细胞浸润水平最高，特别是活化的CD4⁺/CD8⁺ T细胞、树突状细胞和巨噬细胞。该分型也与肿瘤分级、FIGO分期、生存状态等临床病理特征显著相关。

Construction of the NecropImmScore for prognostic, immune microenvironment, and immunotherapy response stratification of OC patients

基于102个预后基因的表达矩阵进行主成分分析(PCA)，研究人员构建了定量化的NecropImmScore。结果表明，高NecropImmScore患者的总生存期显著长于低分患者(p<0.001)。该评分能有效区分具有不同免疫微环境特征的肿瘤：高分肿瘤表现出更高的免疫细胞浸润（如活化的CD4⁺ T细胞、NK细胞、M1巨噬细胞等）和免疫检查点分子（PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、TIGIT等）表达。在IMvigor210免疫治疗队列中，高NecropImmScore与更高的IPS评分和更好的免疫治疗反应相关，表明其能预测ICB疗效。

The NecropImmScore as a multifaceted biomarker for prognosis, immunotherapy, and genomic instability in OC patients

多变量Cox回归分析证实NecropImmScore是独立的预后因素(HR=0.9406, p=1.74e-05)，并在ICGC独立队列中得到验证。突变分析发现，高分组BRCA1突变频率显著更高。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示，NecropImmScore预测BRCA1缺陷的曲线下面积(AUC)达0.802。将NecropImmScore与BRCA1突变状态结合，能实现更优的预后分层(p<0.001)。此外，NecropImmScore与同源重组缺陷(HRD)评分呈正相关，且高分/高HRD评分患者预后最佳。在IMvigor210队列中，高NecropImmScore预示着抗PD-L1治疗后的生存获益和客观缓解率提升，并与"炎症型"TME表型和更高的肿瘤新抗原负荷(TNB)相关。NecropImmScore与高肿瘤突变负荷(TMB)结合，能进一步优化预后分层。药物敏感性分析还提示，高分患者对顺铂、紫杉醇、吉西他滨等标准化疗药物可能更敏感。

讨论与结论

本研究确立了MLKL作为卵巢癌抗肿瘤免疫的关键调节因子，其通过驱动趋化因子介导的免疫细胞招募和TME重编程，发挥保护性作用。所构建的NecropImmScore是一个多功能的生物标志物，不仅能有效预测预后，还能识别对免疫治疗和化疗可能应答的优势人群，并反映BRCA1缺陷和基因组不稳定性状态。该评分超越了传统的单一生物标志物，通过整合坏死性凋亡与免疫特征，为卵巢癌的精准分型、治疗策略选择和预后评估提供了强有力的新工具，具有重要的临床转化潜力。未来需要在前瞻性临床试验和更复杂的体内模型中进一步验证其价值，并探索将其转化为临床适用检测方法的路径。