肿瘤内皮细胞通过PDGF-AA/PDGF-C-EphA2/AKT/P38信号轴促进肿瘤转移起始的机制研究

《Cell Communication and Signaling》：Crosstalk between tumor endothelial cells and cancer cells is important for metastasis initiation

本研究针对肿瘤转移起始过程中内皮细胞与肿瘤细胞间相互作用的机制尚不明确的问题，通过比较正常内皮细胞(NEC)与肿瘤内皮细胞(TEC)的功能差异及其对肿瘤细胞行为的影响，揭示了TEC通过高分泌PDGF-AA和PDGF-C等血管分泌因子，显著促进肿瘤细胞的趋化、侵袭及与内皮细胞的粘附，进而驱动转移起始的关键步骤。研究证实TEC与肿瘤细胞共注射可显著增强原位乳腺肿瘤的生长和肝转移，并阐明了PDGF-C通过激活EphA2/AKT/P38/ERK信号通路调控肿瘤细胞侵袭的分子机制。该研究为理解肿瘤微环境中血管内皮细胞的主动调控功能提供了新视角，并为开发针对血管分泌信号网络的抗转移策略提供了潜在靶点。

　　

癌症之所以成为人类健康的主要威胁，很大程度上并非源于原发性肿瘤本身，而是由于其扩散到身体其他部位的能力，即转移。转移过程如同一场复杂的多步骤“远征”，癌细胞需要离开原发地，侵入周围组织，渗入血管，在血液中幸存，最终在遥远的器官中“安家落户”。在这一系列艰巨的挑战中，与血管系统的互动是癌细胞成功“远征”的关键限速步骤。传统观点认为，血管内皮细胞主要扮演着被动的“管道工”角色，负责为肿瘤提供养分和氧气。然而，越来越多的证据表明，肿瘤内的内皮细胞（Tumor Endothelial Cells, TEC）并非静态的旁观者，它们能够主动分泌一系列被称为“血管分泌因子”（angiocrine factors）的信号分子，从而深刻地影响肿瘤的恶性进展。尽管如此，这些血管分泌因子在转移起始阶段，特别是在调控癌细胞朝向血管的趋化运动、侵袭基底膜以及粘附于血管壁等早期事件中的具体作用，仍然是一个亟待阐明的科学问题。

为了深入探究肿瘤内皮细胞在转移起始中的主动角色，来自哥本哈根大学生物技术与创新中心（BRIC）的Victor Oginga Oria、Janine Terra Erler及其合作者在《Cell Communication and Signaling》上发表了一项研究。他们系统性地比较了正常内皮细胞（NEC）与肿瘤内皮细胞（TEC）的功能特性，并重点揭示了TEC通过其独特的分泌组，特别是血小板衍生生长因子PDGF-AA和PDGF-C，促进肿瘤细胞恶性行为及其背后的分子机制。

研究人员首先对NEC和TEC进行了全面的功能表征。他们发现，与NEC相比，TEC表现出更强的增殖能力、迁移能力和成管能力。在受到肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或血管内皮生长因子（VEGFA）激活后，TEC形成的单层屏障也表现出更高的通透性。这些结果提示TEC本身具有更促肿瘤的活性表型。

为了模拟体内内皮细胞通过分泌因子影响肿瘤细胞的环境，研究人员收集了NEC和TEC的条件培养基，并用其处理小鼠胰腺癌KPC细胞和乳腺癌4T1细胞。结果发现，TEC条件培养基能比NEC条件培养基更显著地促进这两种癌细胞的增殖、趋化迁移和三维侵袭。更有趣的是，当将荧光标记的癌细胞与荧光标记的内皮细胞共培养时，癌细胞更容易粘附到TEC单层上，而不是NEC单层上。这些体外实验有力地证明，TEC分泌的因子能够有效地促进转移起始所需的多个关键步骤。

为了揭开TEC条件培养基“神通广大”背后的秘密，研究人员采用了液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术对其分泌组进行了无标记定量蛋白质组学分析。分析结果显示，TEC和NEC的分泌蛋白谱存在显著差异。在TEC条件培养基中，PDGF-AA、PDGF-C和VEGFA等因子的水平显著高于NEC。生物信息学分析表明，这些差异分泌的蛋白与PI3K-AKT、MAPK、RAS等癌症相关信号通路的富集密切相关。

基于质谱结果，研究团队将目光聚焦于PDGF-AA和PDGF-C。他们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）验证了TEC确实分泌更高水平的这两种蛋白。进一步的功能实验表明，外源重组的PDGF-AA和PDGF-C虽不能刺激癌细胞增殖，但能显著增强癌细胞的趋化迁移和侵袭能力。然而，它们并不影响内皮细胞的成管能力或通透性，这说明它们主要扮演着针对肿瘤细胞的“旁分泌”信使角色。在机制层面，Western blot分析显示，用PDGF-AA或PDGF-C处理癌细胞后，能够激活P38、AKT和ERK1/2的磷酸化。在4T1细胞中，还观察到了EphA2受体在S897位点的磷酸化水平升高。

为了确认PDGF-AA和PDGF-C在TEC介导的促转移效应中的必要性，研究人员使用了特异性的中和抗体。结果显示，中和TEC来源的PDGF-C能显著抑制TEC条件培养基诱导的癌细胞趋化和侵袭，并伴随EphA2、AKT、P38和ERK1/2磷酸化水平的下降。而中和PDGF-AA的效果在4T1细胞中较弱，在KPC细胞中则不显著，提示PDGF-C可能是TEC促转移效应中更关键的因子。

研究的最后部分通过体内实验验证了TEC的促瘤作用。在免疫 competent的BALB/c小鼠乳腺脂肪垫中原位注射4T1癌细胞与TEC的混合物，与只注射4T1细胞或4T1与NEC混合物的对照组相比，4T1+TEC组的小鼠其原发性肿瘤生长速度显著更快，并且肝脏中的转移灶数量也明显更多。对肿瘤组织的免疫组化分析显示，4T1+TEC肿瘤中PDGF-AA、PDGF-C的表达水平以及EphA2(S897)、AKT(S473)和P38(T180/Y182)的磷酸化水平均显著高于对照组，这与体外实验的发现相互印证。

主要技术方法概述

本研究综合利用了体外细胞模型与体内动物模型。关键实验技术包括：细胞增殖、迁移（划痕愈合和Transwell小室）、侵袭（3D球体侵袭）、血管通透性、体外成管形成和球体出芽等功能实验；蛋白质印迹（Western blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）进行蛋白表达和磷酸化水平检测；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分泌组蛋白组学分析；以及利用免疫 competent小鼠构建原位乳腺肿瘤模型和实验性肝转移模型进行体内验证。

TEC具有比NEC更活跃的表型

研究人员通过一系列实验证实，TEC在增殖、迁移（划痕愈合）和成管/出芽能力上均优于NEC。在受到TNF-α或VEGFA刺激后，TEC单层也表现出更高的通透性。这些结果表明TEC本身处于一种更易于支持肿瘤进展的状态。

TEC条件培养基促进癌细胞增殖、趋化、侵袭和粘附

研究发现，与NEC条件培养基或对照培养基相比，TEC条件培养基能更有效地刺激KPC和4T1癌细胞的增殖、趋化迁移和三维侵袭。此外，癌细胞与TEC单层的粘附效率也高于与NEC单层的粘附。

分泌组分析揭示TEC高分泌PDGF-AA和PDGF-C

通过对NEC和TEC条件培养基进行蛋白质组学分析，研究人员鉴定出154个差异表达的蛋白质，其中62个在TEC中高表达。特别值得注意的是，PDGF-AA和PDGF-C在TEC条件培养基中含量显著更高。生物信息学分析提示这些因子与PI3K-AKT、MAPK等促癌信号通路相关。

PDGF-AA和PDGF-C促进肿瘤细胞的趋化和侵袭

功能验证实验表明，外源性PDGF-AA和PDGF-C能显著增强癌细胞的趋化迁移和侵袭能力，但不影响其增殖。信号通路检测显示，这两种因子能激活P38、AKT、ERK1/2，在4T1细胞中还能激活EphA2(S897)的磷酸化。

中和PDGF-C抑制TEC介导的癌细胞趋化和侵袭

使用特异性中和抗体阻断TEC条件培养基中的PDGF-C（而非PDGF-AA）后，TEC对癌细胞趋化和侵袭的促进作用被显著抑制，同时EphA2/AKT/P38/ERK信号通路的激活也被减弱，证明了PDGF-C在TEC促转移效应中的关键作用。

TEC在体内促进原发性肿瘤生长和肝转移

在小鼠原位乳腺肿瘤模型中，与4T1细胞共注射的TEC显著促进了原发性肿瘤的生长速率和肝脏转移负荷。对肿瘤组织的分析显示，4T1+TEC组肿瘤中PDGF-AA、PDGF-C的表达以及EphA2/AKT/P38信号通路的激活水平均更高，与体外实验结果一致。

综上所述，本研究清晰地揭示了肿瘤内皮细胞（TEC）在转移起始阶段扮演着积极的“帮凶”角色。它们通过分泌高水平的PDGF-AA和PDGF-C等血管分泌因子，以旁分泌方式激活肿瘤细胞内的EphA2/AKT/P38/ERK信号轴，从而显著增强肿瘤细胞的趋化运动和侵袭能力。同时，TEC自身对VEGFA等促血管生成因子具有更高的反应性，也促进了肿瘤血管的生成和通透性。体内实验进一步证实，TEC的存在能够加速原发性肿瘤的生长并促进肝转移的发生。这项研究不仅深化了我们对肿瘤微环境中细胞间通讯的理解，将内皮细胞的功能从单纯的营养输送者扩展为转移的主动调控者，更重要的是，它识别出PDGF-C/EphA2信号轴等潜在的干预靶点，为开发旨在阻断转移起始的新型治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。未来的研究可以进一步探索针对特定血管分泌信号通路在抑制癌症转移方面的治疗潜力。